快速低成本全基因组DNA测序技术

27卷2期2008年4月

中　国　生　物　医　学　工　程　学　报

ChineseJournalofBiomedicalEngineeringVol.27　No.2

April　2008

快速低成本全基因组DNA测序技术

　

陆祖宏　吕　华　肖鹏峰　白云飞

(东南大学分子电子学国家重点实验室,南京　210096)

3

摘　要:人类个体的全基因组序列信息,是最为重要的生物医学信息,是实现未来个体化医疗的基础;实现个体全基因组DNA序列的快速低成本检测,是人类基因组计划完成后又一个重要的技术挑战。对该技术当前的发展现状进行回顾和分析,预计在不长的时间内人类个体全基因组的测序成本能够降低到1。关键词:全基因组测序;个体化医疗;功能基因组学;快速Ultra2Low2CostandDNASequencing

ongHua　XIAOPeng2Feng　BAIYun2Fei

(StateeyLaboratoryforBioelectronics,SoutheastUniversity,Nanjing210096)

Abstract:Thewholegenomicinformationfromindividualsisthemostimportantbiomedicalinformation,whichisessentialforfuturepersonalmedicine.Torealizetheultra2fastandultra2low2costsequencingofpersonalwholegenomesisthenewchallengeafterthecomplementofhumangenomeproject.Inthispaper,wereviewedthenewdevelopmentofthistechnology.Itisexpectedthatthecostofthewholehumangenomesequencingwillbereducedtobelow10000RMB.

Keywords:genomesequencing;personalmedicine;functionalgenomes;deepDNAsequencing

中图分类号　R318　　文献标识码　A　　文章编号025828021(2008)0220182205

引言

　　人类基因组计划是人类科学发展史上的一项伟大工程。1990年开始,人类用了12年的时间完成了人类遗传密码30亿对碱基序列的测定术的研究

[4]

[1-3]

有增无减,DNA测序技术仍在日新月异地高速发展。以当前最为先进的ABIPrism3730DNA测序仪为例,阅读长度是800bp,平均每个碱基的成本是01008美元。要完成一个30亿碱基的测序,需要150台ABIPrism3730DNA测序仪运转一年,测序

R○

R○

。国际

人类基因组计划委员会一直高度重视DNA测序技

。在整个人类基因组计划执行过程中,

基因组DNA测序成本迅速下降,测序速度快速提高,DNA测序仪自动化水平突飞猛进。毛细管阵列电泳仪的发明,以及1995年自动化测序仪的出现,使得每一个碱基的测序成本降至1美元,单台仪器的测序速度提高到100000bpΠ天;1998年ABIPrism

R○

成本接近2400万美元

[5]

。近年来,DNA测序成本以

每两年降低一半的速度递减,2006年2月份完成的弥猴基因组草图的费用为2200万美元。尽管如此,目前通用毛细管阵列DNA测序方法在成本和耗时方面,仍然远远满足不了生命科学和医学发展的要求,这也极大地制约了DNA测序市场的发展。

功能基因组研究的目的是要认识基因组中每个核酸的生物学含义,发现疾病易感基因。功能基因组的研究途径是比较基因组学,即通过比较和分析不同表型个体之间基因组序列差异,解码基因组中每个核酸的生物学意义,发现功能基因,识别与疾病相关的分子遗传信息;进一步,根据个体基因组信

3700DNA自动化测序仪的推出,每一个碱基的测序

成本降低到011美元,测序速度达到900000bpΠ天。正是测序技术的发展,才使得人类基因组计划得以提前顺利完成。

,人类对于测序技术的需求

收稿日期:2007208209,修回日期:2007211208。3通讯作者。　E2mail:[email protected]

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息,实现疾病的预测、预防和个体化治疗。随着功能基因组研究的发展以及人们对提高医疗健康水平的不懈追求“,个体化医疗”即将进入人们的生活。为了真正实现“个体化医疗”这一目标,首先要对每个人的基因组进行测序,找出不同个体在DNA序列上的差异与不同疾病、发育等的相关性。但是,大规模个体全基因组DNA的测序,即对大量的人类个体的基因组DNA(包含有30亿碱基)进行再测序,其成本仍太高。这严重地限制了功能基因组的研究进展,影响到人类基因组计划的研究成果的应用。对于目前的基因组测序成本而言“个体化医疗”,仍然是人类的一个遥远的梦想。

当然,。人类单核苷酸多()列(microarray)芯片[6],筛选相关差异的SNPs,寻找相关基因的功能。但是,SNPs仅仅代表人类群体基因组中一类正常的单核苷酸差异,它们大多与疾病的关系并不密切。因此,目前人们在进行SNP相关的表型分析时,大多很难得到明确的结论。而对于人类基因组中存在的与功能相关的大量未知变异信息,目前的SNP技术显得无能为力。

目前,国际学术界已经清醒地认识到发展快速低成本的人类个体基因组再测序技术的重要性。2002年,美国科学家JCraigVenter首先发出了发展1000美元人类全基因组测序技术的倡议,他领导的基金会承诺给第一个实现1000美元人类全基因组测序的个人或单位颁发50万美元的奖金。美国国立卫生院(NIH)下属的人类基因组研究所(NationalHumanGenomeResearchInstitute,NHGRI)随即于2004年启动了3800万美元的计划,资助低成本DNA测序新技术的研究。现在美国NIH投在DNA测序创新技术研究方面的经费已经上亿美元。2006年10月美国加州SantaMonica的XPrize基金会取代了J.CraigVenter基金会的奖励计划,并把奖金额度提高到了1000万美元,成为有史以来生物医学领域奖金额度最高的科技奖。美国国家人类基因组研究所(NHGRI)主任FrancisS.Collins博士指出:“大幅度降低DNA测序的成本将会导致全新的生物医学研究模式,甚至将会产生医学实践的革命。”美国NIH的近期目标是:计划在5年内将DNA测序的成本下降100倍以上,最终在10年内使得测序成本降至1000美元。如何实现个体全基因组DNA序列的快

速、有效、低成本测定,已是当今国际基因组科学及其应用所面临的重要挑战之一,也是我国生命科学和医学发展面临的又一次大的机遇。国家科技部在2006年启动的“十一五”863“生物芯片”重点项目中,对低成本快速人类全基因组的测序技术和相关仪器的研究进行了重点支持。该项目提出了1万人民币全基因组测序的目标。在未来的5年中,发展出相应的DNA测序模板芯片、试剂和相关的DNA测序仪,并争取实现产业化。

新一代DNA,即,SBH)、合,SBS)和DNA单分子DNA测序创。

[7-9]

1　杂交测序

[10-12]

　　杂交测序是根据DNA分子中碱基互补配对的特性,通过标记的单链DNA模板,与一系列短链寡核苷酸探针分子杂交,来实现DNA测序的策略。这些寡核苷酸探针分子被固定在玻片或者其他固相支持物的表面,制备成生物芯片,待测序的模板DNA分子只能与生物芯片中序列完全互补的探针进行特异性的杂交,根据杂交信号的分布,进行基因组序列的拼接和组装。从头测序(denovosequenceing)芯片是把给定长度的所有可能序列的寡核苷酸固定作为

8

探针,例如对于八聚体的寡核苷酸可能的探针有4=65536种,被测序的模板DNA分子与生物芯片中的寡核苷酸探针杂交后,借助于计算机对所有发生杂交的寡核苷酸探针序列通过相互之间重叠序列信息进行拼接,进而重建模板DNA分子的序列。

杂交测序的优点是检测速度快,采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本。但是,该方法同样存在着致命的缺点。由于序列相似的模板DNA和探针DNA在形成双螺旋结构方面的稳定性差别很小,模板和探针之间的杂交存在不可避免的非特异性,因而容易造成信号的假阳性。另外,杂交测序方法可能无法阅读人类基因组中大量的重复序列。

2　合成测序

　　合成测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定,并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物,分别控制4种碱基在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸碱基,

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[19,20]

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实现高通量并行的DNA序列信息的检测。在合成

测序策略中,测序引物首先和待测序的DNA模板结合,然后依次加入4种脱氧核苷酸,引物以被测DNA片段为模板,在DNA聚合酶的催化下逐步延伸。此过程中,有多种方法可以用来确定引物是否发生延伸反应,并根据所加入的相应的脱氧核苷酸种类,确定DNA模板上的碱基信息。通过4种脱氧核苷酸循环加入,或者按照指定的顺序加入,最终获取所需

[13]

要的核酸阅读长度。

罗氏(Roche)公司旗下的454LifeSciencesCorp.已经推出了商品化的仪器。该仪器中使用了焦测序(pyrosequencing)技术。首先将基因组分割为长度为300到500个碱基对的片段,,互补链当中的一条,上的复合物结合,结合。随后通过反(polymerasechainreaction,PCR),,直到各个片段的拷贝完全覆盖其所在的小珠为止。接

2

下来将珠子分散在一个大小为6×6cm、包含大约160万个小孔的平板(picotiterplate)上,并加入一系列的测序试剂和核苷酸。每当一个核苷酸被添加到正在延伸的DNA链当中时,该反应会释放一个焦磷酸(PPi)分子,随即在ATP硫酸化酶的催化下与腺苷酰硫酸反应生成ATP,在位于小孔中的荧光素酶催化下该ATP被用于促进D2虫萤光素发光。用CCD将每个微球发出光及其强度进行同时成像,并将所记录下的发光现象与当时加入的核苷酸相关联,可以得到同时发生的几十万个DNA片段的延伸情[14-18]况。

2005年8月,454LifeSciences的研究人员报道,

原理。Solexa的方法为克隆单分子阵列(Clonal

TM

SingleMoleculeArray)技术,是将待测序的单个基因组DNA片段固定在载玻片表面不同的位置上,如同在DNA微阵列中所做的那样,形成随机排列的单分子阵列。随后,对这些单个的DNA片段同时进行复制,生成大量微小的DNA簇(DNAcluster)。复制过程将每个DNA片段转换为大约1000个完全一样的拷贝,并位于同一个DNA簇之中。最后,在与Sanger测序方法类似的步骤中,分别采用4种不同颜色荧光基团标记的,以及标准的。Solexa的测序技术可以DNA单链分子的序列,从而能。该技术借助于产生极高密度的单分子阵列,将全基因组分析的大规模并行处理(massivelyparallelprocessing)和“一管”样品制备(one2tubesamplepreparation)相结合,在降低基因组测序的成本和提高测序的效率方面取得了重要性的突破。Solexa公司提出了许多使单分子测序技术实用化的化学和酶学方面的创新技术,设计了结构新颖的可逆终止核苷酸单体(reversibleterminator)和拥有一系列天然酶分子所不具备性质的新型酶分子,从而实现了这种全新的测序方式。

Solexa用这种方法对人类DNA中长度为162kb的片段进行了测序,并与人类基因组计划得到的标准参考序列进行比较,其测序结果的准确率超过99199%,并且发现了已知在这个片段中存在的全部162个常见的SNP突变位点。2007年初,Illumina生物芯片公司以6亿美金的价格收购了Solexa,现在已经推出使用该技术的商品化测序仪Illumina1GGeneticAnalyser。该仪器运行一次需要48～72h,每个测序片段的阅读长度为25～35个碱基,这样可以产生1Gb的序列。

[21]

Church等发明了另一种不同的测序方法,该方法的一部分已经授权给Agencourt公司,并在2006年7月被应用生物系统公司(AB)收购,发展为SOLiD(SupportedOligoLigationDetection)测序技术。与使用DNA聚合酶的测序技术不同,在这种方法中使用了DNA连接酶进行测序,因此也被称作为连接测序(sequenceingbyligation)。在该方法中,DNA片段文库生成以后,首先将短的DNA片段固定在微珠上,并通过乳液PCR进行扩增;然后将含有扩增后片段的微珠以阵列的方式排布,再加入测序引物,与固定在每个微珠上的DNA片段中已知的起始序列

他们已经对Mycoplasmagenitalium将近60万碱基的基因组进行了测序,同时被测序的还有较大的Streptococcuspneumoniae包含210万碱基的基因组。2006年初,该公司报道了他们已经完成对四种不同微生物基因组的测序,并且准确率都超过99199%。今年年初新推出的GenomeSequencerFLX测序仪阅读长度达到200bp,每次实验可测序1000MB。2007年5月底,454LifeSciences和贝勒医学院人类基因组测序中心合作,使用该公司的GenomeSequencerFLX测序仪,只用了两个月的时间,就完成对DNA

双螺旋的发现者之一沃森的个体全基因组序列测定,其测序成本不到100万美元。

由英国剑桥大学派生的Solexa公司,在其测序方法中采用了与454LifeSciences不同的合成测序

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发生结合。随后,向混合物中加入长度为8个碱基的荧光标记寡核苷酸探针。这些探针从3′端开始的第5个碱基为查询碱基,分别用4种不同的荧光标记表示A、G、T或者C,共分为4组。如果一条带有正确互补序列的探针与DNA发生结合,DNA连接酶将把它与测序引物进行连接,使得它被固定在表面上,而其他结合得不够牢固的探针分子都会被洗去。接着,用激光来激发探针上的荧光标记分子,从而获得新结合上碱基的信息。最后,将探针剩余部分和荧光标记切除。在新一轮的测序过程开始时,重复连接、荧光检测和切除步骤,得到第10个碱基的信息。类似地,在第三轮中可以获取第15个碱基,第四轮中获取第20个碱基,依此类推物(nestedsequencing)。。不仅如此,两个碱基,这样在测序过程中每个碱基被测序两次,可以根据两次结果是否一致对测序中的错误加以识别,从而提高碱基读出的准确性。2007年6月,AB公司向市场推出了使用该方法的SOLiD测序系统,该系统每运行一次产生大约1Gb的碱基序列信息。目前,该系统已经成功地用于对C.elegans和E.coli的再测序。在对E.coli的再测序结果中,该方法发现了一个用Sanger测序法拼接时遗漏的大重复序列。

尽管合成测序方法已经取得了重要的进展,但它本身也有一些问题和缺点。例如,合成测序方法的阅读长度相对较短,每个DNA片段的测序长度通常在100个碱基以下,而当前毛细管电泳测序系统的阅读长度可达到1000个碱基。较短的阅读长度将使得从测得的DNA片段拼接成一个连续的基因组序列的难度大幅度增加。同时,在测序过程中,同一分子的若干拷贝之间由于延伸的同步性逐渐降低,将降低测序的准确性。当然,随着技术的改进和对新型测序技术的应用经验积累,将会逐步提高测序的长度和进度。例如,454正在研制最新的测序仪器,可以使得阅读长度从100增加到200个碱基以上。

另外,在现有合成测序方法中,DNA测序模板阵列的制备依赖于PCR扩增,这不仅在测序模板的扩增拷贝过程中容易引入复制错误,而且PCR扩增存在明显的偏向性,这对于有效地获得全基因组测序模板阵列形成了重要的技术瓶颈。与上述通过乳

液PCR或者是桥式扩增方法对模板DNA片段进行扩增不同,提出了一种新型的用于合成测序方法的DNA测序模板阵列的制备方法。该方法采用单分子放大技术,实现基因组DNA片段的定点扩增,从而构建单分子多拷贝的微阵列芯片。通过使用滚环复制酶合成DNA片段的多拷贝单分子(multi2copysinglemolecular)测序模板,并通过制备多拷贝单分子阵列来实现高并行性的合成测序。在这种模板制备方法中,借助于等温扩增的滚环复制过程,能够基,扩增的误差小,。由于该方法避免,直接在,因而有可能实现单分DNA片段同时进行测序,通过一个或数个芯片实现极高通量测序的。

3　单分子测序

　　为了进一步解决合成测序的问题,国际上一些研究小组正在研究直接对单拷贝的DNA分子进行测序的方法。这些单分子测序技术有可能实现更长的阅读长度,并且避免了对模板分子的扩增。单分子测序技术还有一些优点,如试剂的消耗量大大下降、只需要少量的模板等。然而,单分子水平的信号检测是所有单分子测序技术目前面临的一个极大挑战。研究人员设计了不同的测序化学和技术方案来进行单分子测序。其中,一些方法仍然建立在合成测序的基础之上,并采用了特别的检测方式;另一些方法则通过外切酶将所有碱基被标记的DNA模板上的标记碱基依次逐个切除,并进行检测,一些研究人员对此加以改进,对非标记的碱基直接识别;还有一类技术使用纳米孔作为碱基传感器,诱导DNA分子蜿蜒通过非常细微的纳米孔道,在这个过程中借助于电子学或者光学的方法对碱基进行读出。

位于休斯敦的VisiGenBiotechnologies公司对聚合酶和脱氧核苷酸进行了修饰,把一种荧光供体分子结合在聚合酶上,另外4种荧光受体分子则用于分别标记A、T、C、G共4种脱氧核苷酸分子。在进行测序时,把聚合酶分子固定到表面上,结合模板链后加入荧光标记的核苷酸,伴随着在聚合酶催化下引物的延伸,聚合酶和核苷酸分子之间发生荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)现象。光学系统记录下来自于单个核苷酸分子的特异性的微弱发光,从而对DNA的碱基序列进

[29]

行实时、连续和快速的阅读。

LI2CORBiosciences公司正在研究单分子测序方

法,将单链DNA分子和聚合酶固定到电极的表面,

并采用一种碱基上修饰了电荷基团、同时在-磷酸上标记了荧光的脱氧核苷酸用于测序反应。测序时,在电场的作用下,将脱氧核苷酸从溶液中向聚合酶分子移动。在聚合酶分子与核苷酸发生结合时,研究人员将电场反转,除去未与DNA结合的脱氧核苷酸;随后,他们采集一幅图像来观察仍然和聚合酶结合的标记核苷酸的荧光特征。当核苷酸加入到正在延伸的链中时γ,2磷酸上标记的荧光被切除,这一过程被重复地进行,以确定下一个碱基的性质。LI2COR的JohnWilliams预测,该方法的阅读长度可以达到2万个碱基。

Helicos单分子测序装置。链DNA片段的末端与。随后,这些单链DNA片段通过末端的通用引物序列,与流动池表面的互补通用引物序列杂交而结合。通过激发Cy3标记的荧光,确定每个DNA片段在流动池表面上的位置。在测序反应时,加入聚合酶以及4种用Cy5标记的脱氧核苷酸中的一种,在聚合酶的催化下,碱基在对应的互补位置上被掺入。随后,通过激发Cy5荧光,确定那些掺入碱基而发生延伸反应的引物所在的位置。接着去除Cy5分子,并更换一种Cy5标记的脱氧核苷酸进行测序反应。整个过程使用四种标记脱氧核苷酸循环进行,直到获得所需要的阅读长度。Helicos报道,第一代Heliscope的单分子测序装置每天可以产生1Gb的测序结果,而成本只有当前Sanger法测序的1%。

与上面这些基于DNA生物化学原理的测序方法不同,一种完全基于物理原理的纳米孔测序(nanoporesequenceing)方法正在吸引人们的注意。该方法是当DNA分子通过一个直径约为115nm左右的小孔时,利用不同的碱基引起纳米孔周围的静电感应变化或离子通过能力的差异来对其进行测[23-27]序。JohnKasianowicz和DanielBranton报道,他们可以使用嵌入在脂质膜内的蛋白质微孔来检测DNA片段,而且可以区分由碱基A或C组成的DNA

[23]

片段。

由于蛋白质和脂质的结构稳定性差,人们使用硅和其他电子材料来制作纳米孔,可以在纳米孔周围制作晶体管等其他的电子器件。人们使用微小的晶体管来控制通过小孔的电流,当4种不同的碱基

[22]

通过小孔时,它们对电信号影响的方式不同,导致电压上升或者下降,可以依据这种微小的改变来确定通过DNA上碱基的类型。GregoryTimp的实验指出,DNA通过小孔时能够产生电信号的变化。不过,由于DNA分子在溶液中的结构涨落很大,获得直而长的DNA分子链对于提高测序的精度是十分重要的。Timp和同事正在使用电场来控制DNA分子运动。该技术有望能够快速阅读更长的DNA片段,。

4展望

,关,寻找人类不同个体性,特别是复杂疾病易感性、预后和药效的个体差异的基因型,正在成为医药界的研究热点,而这些研究和应用的规模将直接取决于DNA测序成本的降低。目前,高通量低成本的DNA测序技术产业已开始在美国形成,一个高速成长的DNA测序产业正在全球兴起。随着低成本快速DNA测序产业的发展,DNA测序市场将会爆发性地增长。如果以1000美元测序成本和全球60亿人口来估算,人类个体化基因组的市场容量为6万亿美元,我国的市场容量将达到10万亿人民币。这里还没有包括各种与人类相关的病源微生物和人类疾病基因组的表达差异等临床诊断的需求,而这部分的市场容量更大。同时,个体化人类基因组带动的相关生物技术产业(如医学、制药、农业等)将会像微电子技术给信息产业带来的变革一样,将会有数万、数亿倍的带动效应。

参考文献

[1][2][3][4][5]

LanderES,LintonLM,BirrenB,etal.Initialsequencingandanalysisofthehumangenome[J].Nature,2001,409:860-921.VenterJC,VenterJC,AdamsMD,etal.Thesequenceofthehumangenome[J].Science,2001,291:1304-1351.

CollinsFS,GreenED,GuttmacherAE,etal.Avisionforthefutureofgenomicsresearch[J].Nature,2003,422:835-847.ChanEY.Advancesinsequencingtechnology[J].MutationResearch,2005,573:13-40.

FredlakeCP,HertDG.,MardisER,etal.Whatisthefutureofelectrophoresisin

[6]

large2scale

genomic

sequenceing

[J].

Electrophoresis,2006,27:3689-3702.

LipshutzR,FodorS,GingerasT,etal.Highdensitysyntheticoligonucleotidearrays.[J].NatureGeneticsSupplement,1999,21:20-24.

(下转第190页)

[3]

GruberDM,HuberJC.Tissuespecificity:theclinicalimportanceofsteroidmetabolitesinhormonereplacementtherapy[J].Maturitas,2001,37(3):151-157.

[7]

MuramatsuT,MiyauchiT.Basigin(CD147):amultifunctionaltransmembraneproteininvolvedinreproduction,neuralfunction,inflammationandtumorinvasion[J].HistolHistopathol,2003,18(3):981-987.

[4][5]

BensonDA,Karsch2MizrachiI,LipmanDJ,etal.GenBank[J].NucleicAcidsRes,2005,33(DatabaseIssue):D34-D38.BairochA,ApweilerR,WuCH,etal.TheUniversalProteinResource(UniProt)[J].NucleicAcidsRes,2005,33(DatabaseIssue):D154-D159.

[9][8]

HarrodTR,JustementLB.EvaluatingfunctionoftransmembraneproteintyrosinephosphataseCD148inlymphocytebiology[J].ImmunolRes,2002,26(1-3):153-166.

JahrmannT,BastidaM,PinedaM,etal.StudiesonthefunctionofTM20,atransmembraneproteinpresentincerealembryos[J].Planta,2005,222(1):80-90.

[6]KudlaKM,BlakemoreM.SNOMEDtakesthenextstep[J].JAHIMA,2001,72(7):62,64-68.

(上接第186页)

[7][8][9]

KlingJ.UltrafastDNAsequenceing[J].NatBiotechnol,2003,21:1425-1427.

MetzkerML.EmergingtechnologiesinDNAsequenceing[J].GenomeResearch,2005,15:1767-1776.

ShendureJ,MitraRD,VarmaC,.technologies:[JGenetics,2004,5:335-344.

[10]

DrmanacR,LabatI,RR,etal.SequencingofmegabaseplusDNAbyhybridization:theoryofthemethod[J].Genomics,1989,4:114-128.

[11]

DrmanacS,KitaD,LabatI,etal.AccuratesequencingbyhybridizationforDNAdiagnosticsandindividualgenomics,[J].NatBiotechnol,1998,16:54-58.

[12]

′D,StrezoskaZ,PauneskuT,Radosavljevic

437:-,MJ,etal.Geneexpressionanalysisparallelsignaturesequencing(MPSS)onmicrobead[J].NatureBiotechnol,2000,18:630-634.

[20][21]

BennettST,BarnesC,CoxA,etal.Towardthe＄1000humangenome[J].Pharmacogenomics,2005,6:373-382.

ShendureJ,PorrecaG.J,ReppasNB,etal.Accuratemultiplexpolonysequencingofanevolvedbacterialgenome[J].Science,2005,309:1728-1732.

[22]

BraslavskyI,HebertB,KartalovE,etal.SequenceinformationcanbeobtainedfromsingleDNAmolecules[J].ProcNatlAcadSci,U.S.A,2003,100:3960-3964.

[23]

KasianowiczJJ,BrandinE,BrantonD,etal.Characterizationofindividualpolynucleotidemoleculesusingamembranechannel[J].ProcNatlAcadSci,U.S.A,1996,93:13770-13773.

[24][25]

MellerA,NivonL,BrantonD.Voltage2drivenDNAtranslocationsthroughananopore[J].PhysRevLett,2001,86:3435-3438.DeamerDW,AkesonM.Nanoporesandnucleicacids:prospectsforultrarapidsequencing[J].TrendsBiotechnol,2000,18:147-151.

[26]

AshkenasyN,SanchezQuesadaJ,BayleyH,etal.RecognizingasinglebaseinanindividualDNAstrand:asteptowardDNAsequencinginnanopores[J].AngewChemIntEdEngl,2005,44:1401-1404.

[27]

AstierY,BrahaO,BayleyH.TowardsinglemoleculeDNAsequencing:

direct

identification

of

ribonucleoside

and

deoxyribonucleoside5′2monophosphatesbyusinganengineeredproteinnanoporeequippedwithamolecularadapter[J].JAmChemSoc,2006,128:1705-1710.

etal.DNA

sequencingbyhybridization:100basesreadbyanon2gel2basedmethod[J].ProcNatlAcadSciU.S.A,1991,88:10089-10093.

[13][14]

MelamedeRJ.Automatableprocessforsequencingnucleotide[P].U.S.APatent:4863849,1985.

LeamonJH,LeeWL,TartaroKR,etal.AmassivelyparallelPicoTiterPlatebasedplatformfordiscretepicoliter2scalepolymerasechainreactions[J].Electrophoresis,2003,24:3769-3777.

[15][16][17][18]

ElahiE,RonaghiM.Pyrosequencing:atoolforDNAsequencinganalysis[J].MethodsMolBiol,2004,255:211-219.RonaghiM.PyrosequencingshedslightonDNAsequencing[J].GenomeRes,2001,11:3-11.

RonaghiM,UhlenM,NyrenP.Asequencingmethodbasedonreal2timepyrophosphate[J].Science,1998,281:363-365.MarguliesM,EgholmM,AltmanW.E,etal.Genomesequencinginmicrofabricatedhigh2densitypicolitrereactors[J].Nature,2005,