原生质体的制备
拟南芥原生质体转化实验
每次做大反应(用于CO-IP)最多做8管,每管需3 ml 原生质体溶液,浓度为106 ,10 ml 酶液需要40片叶子。小反应用于用于做蛋白定位,每管需200 μl 原生质体溶液
叶片的选取:,取刚刚完全展开,叶面光滑,非凹凸不平的,最上面最中间的叶片,依次向下选取,取瘦长的,叶缘尖锐的叶片为佳。每四棵苗取8-10片叶子。
1. 打开水浴锅,TM=55oC
2. 配40 ml酶解液 (8种试剂)
Cellulose R10 0.6 g 不要粘在管壁上
Macrozyme R10 0.16 g
Mannitol(4 oC) 20 ml
KCl 0.4 ml
MES 4 ml
55 oC,10 min(严格,前边摇2-3次,待管壁不再粘有酶,溶液澄清就不用摇) 待酶液自然降至室温,加入0.4 mL CaCl2 母液以及15.2 mL DDW ,0.04 g BSA,放置于
3. 将0.4 M mannitol 滴至一次性培养皿上,将叶片切成细丝,一刀一刀断开切,忌来回蹭。
4. 23 oC酶解2 h (或3 h,放置时间较长的酶液),40 rpm。收获前75 rpm,摇1 min。
5. 配PEG 100 ml 用 Mannitol(4 oC)
PEG 4000 40 g
DDW 30 ml
Mannitol 25 ml
CaCl2 10 ml
6. 提前将BD 50 ml 离心管置于冰上,尼龙膜过滤收集原生质体,100 g,3min,23 oC,升速3,降速3离心
7. 用5 ml 大枪头吸除酶液,原生质体多则把酶液吸净,少则留一点酶液,加入W5 10-20 ml (依量而定)洗涤。100 g,3min,23 oC,升速3,降速3离心
8. 吸去上清,再加入W5 20 ml,轻摇离心管重悬原生质体。100 g,3min,23 oC,升速3,降速3离心。
9.加入3-9 ml Mmg重悬,使原生质体浓度达到106,冰上放置。
10.取50 ml离心管(大反应),每管加入120 μg 质粒/每一种,然后用枪吸打混匀,阴性对照加一种质粒,然后用水补齐使总体积一致,然后用枪吸打混匀。冰上放置。
11. 50 ml离心管中加入3 ml 原生质体溶液,沿管壁缓慢加入,充分摇匀。
12. 每次室温摇匀后随即每50 ml离心管加入3 ml PEG溶液,轻柔颠倒混匀,不要有PEG溶液一点一点,而应是充分均匀的溶液。加完PEG后每管室温放置6 min。(PEG刚加入时要分层,否则转化效率不好)。
13. 好的情况下,6 min后不应看见有沉渣。加入室温W5 10-12 ml ,马上混匀,终止反应。盖子一定不要盖得太紧,100 g,3min,23 oC,升速3,降速3离心。
14. 用5 ml 枪吸除上清,留约5 ml ,再加入10 ml W5,100 g,3min,23 oC,升速3,降速3离心。
15. 用5 ml 枪吸除上清,留约1-2 ml ,再加入10 ml W5,倾斜放置于白色白炽灯下,液体不要粘在盖子上,用一张白纸遮盖住(光不要太强),放约10-12 h,然后进行后续试验。