细胞培养技术

中国组织工程研究与临床康复笫，２眷多享２９勇亨２００８一０７一１５出版

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Ｅｘ∞ＴｉｍｅｎｔａⅡｓＬ摘要：检索近１０年Ｍｅｄｌｉｎｅ数据库、清华同方全文数据库及相关书籍有关细胞培养技术的文章．详细初审资料，并查看每篇ＩⅡｓ廿１】ｍｃｎｔＣｅｎ嘲：Ｂｅ山咖ｃＭｉｌｉｔａｒｖ

文献后的引文，排除重复研究或Ｍｅｔａ分析类文章。细胞培养技术是成功培养细胞的前提。细胞培养是现代生物科学中发展十Ｍｃｄｉｃａｌ

ｃ０Ｕｅｇｃｔ

分迅速的一种实验技术．细胞培养也是研究病毒与研制疫苗的基础技术，细胞培养的培养物可为单个细胞或细胞群，但细胞培ｓｈＵｉⅡｈｕ啦

养工作十分繁琐，环节较多。标准无菌室的设计、物品的准备、工作规则的制定及注意事项都是细胞培养顺利完成的先决要０５００８１．Ｈ曲ｄ

Ｐｒｏｖｉｌｌ∞．ａ，ｉｌ城素。

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关键词：细胞；培养；文献

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Ｒ∞ｅｉｖｃｄ：２００７・１２—２２

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甘露，张志辉，吕美娜，王琳．细胞培养技术【Ｊ】．中国组织工程研究与临床康复，２００８，１２（２９）：５７３９—５７４２

Ａ∞ｃ删：２００８－０２一１９

作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其他有害

０引言

因素的影响用于细胞培养的实验室在设计上有什么要求呢？所用仪器及制剂有什么要求？保持物品

细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速清洁的工作如何进行呢？用于细胞培养的实验室的

的一种实验技术，它为细胞学、遗传学、病毒学、工作规则有哪些规定呢？

免疫学的研究和应用做出了重要贡献。细胞培养问题２：各种细胞都有自己比较适应的生存环是指从体内组织取出细胞摹期体内出现环境，在境，因此应指明使用的培养基、血清种类、用量以无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使及细胞生存的适宜ｐＨ等

细胞培养的基本条件有

期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技

哪些具体要求呢？通过组织块直接长出单层细胞或１白求恩军医学院仪器中心，河北省术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。细

用酶或机械方法将组织分散戍单个细胞开始培养，石家庄市０５００８ｌ：２解放军胞培养也是研究病毒与研制疫苗的基础技术，因在首次传代前的培养可认为是原代培养．体外培养

陆军指挥学院门诊部，河北省石家

此细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、病的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传

庄市０５００８４

毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用。近代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，甘露★，女，１９６９年生，四川年来发展起来的核移植、细胞杂交、ＤＮＡ介导的并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以省万县人，汉族，２００６年河北医科基因转移以及一些物理图谱的建立。也都需要与

后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，大学毕业，硕士，实验师，主要从事细胞培养紧密结合。但细胞培养工作十分繁琐，

将培养的细胞分散，从容器中取出，以ｌ：２或ｌ：３细胞信号转导研究．

环节较多，探讨细胞培养的条件，对于成功培养细以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传ｗ彻ｇｌｊｎｄｊ＠

１２６．ｃｏｍ

胞具有十分重要的意义。代培养。来源于不同组织成分细胞的原代与传代培中图分类号：Ｒ３９４．２养方法是如何进行的？

文献杯弧码：Ａ文章编号：１６７３－８２２５

１问题的提出

（２∞８）２９—∞７３９埘

问题３：细胞培养过程中还会出现或发生一些影响

细胞培养与人身安全的因素需要注意．

收稿日期：２００７一１２－２２

修回日期：２００８．０２－１９

问题１：细胞培养是一种无菌操作技术，要求工

细胞培养过程中还应注意哪些方面呢？

（０７．５啦！啷５ｌ肛ｗ・囝

５７３９

万　

方数据

２问题的讨论

２．１

问题１的讨论

实验室的设计要求：无菌室空间大小应适度，环境要求清洁、干燥、无烟尘，屋顶装有紫外灯，天花板不宜高过２．５ｍ，以保证紫外线的有效杀菌作用，同时安装空气过滤调节装置，便于臭氧的排出。还应设置面积不小

于６ｍ２的缓冲间及与工作分开的更衣柜等【ｌ】．如果细胞

培养室面积大于一个标准单元，至少应有两个出口，以随时保持畅通。细胞室里的试验台和仪器布局应合理，一般来说，二氧化碳培养箱和净化工作台不应对着门摆放，离心机不应离得太远．实验台面的材料应具有耐磨、耐腐蚀，耐火、防水、绝缘等性能。

超净工作台已得到普遍使用，按气流方向的不同可分为水平流和垂直流２种，以垂直流超净台较为常用，气流从上向下流动，形成气流屏障，能较好地保持台面无菌和操作条件。超净工作台在长期使用过程中可由于灰尘积结过多而阻塞空气过滤器，当发现超净工作台内气流变弱，酒精灯火焰几乎不动时，应及时清洗或更换滤板．

培养的细胞需要经常用倒置显微镜观察其生长情况，以便及时换液，确保细胞具有充足的营养，另外，可以观察细胞培养物是否有污染，便于及时采取补救措施。另外应根据需要选配相差装置、荧光装置、保温装置、缩时拍摄电影装置等。为更好分析处理细胞培养结果，还应配置显微图像捕获装置和相应分析处理系统（合计算机）【¨。

ｃ０２培养箱具有保温、保湿的功能，同时可提供一定量的Ｃ０２，以维持培养液的ｐＨ值。Ｃ０２培养箱应保持清洁，定期用７０％乙醇棉球擦洗消毒。盛水槽内的蒸馏水应定期更换，为防止真菌污染，可在水中加饱和的ＣｕＳ０４等防腐剂。

离心机是细胞培养不可缺少的设备之一，除去培养液中各种不利于细胞生长的成分和代谢产物，或者需调节细胞浓度等均需离心处理。

细胞计数设备一般可借助血细胞计教板进行计数，有条件者可选购电子细胞计数仪．电子细胞计数仪可自动计数细胞悬液中的细胞数。省时省力。

细胞培养所用的培养液等均应放在４℃冰箱，冰箱内应保持清洁，物品放置有序，定期清理。

分析设备常用的是酶标仪、紫外分光光度计．应注意的是应充分考虑波长的选择．

配液设备应配置感量为Ｏ．１一１．０ｍｇ的电子天平、ｐＨ计、磁力搅拌器等．

物品的处理：物品的清洗工作十分重要，新胶塞、污染塞要大量水冲洗，洗去表面污物，洗涤时加一定量的

万　

方数据赛栋？等ｉ黯骑闻充质干细瞻多囱分化潜能韵特征

洗洁精，煮沸２０ｎ皿，流水冲洗后再蒸馏水冲洗，烤干

后高压灭菌。

新购的玻璃器皿先用清水洗净后，用２％稀Ｈｃｌ浸泡

过夜，除去玻璃器皿上的碱性物质．使用过的玻璃器皿

应立即用清水浸泡，洗涤时加入适量洗洁精，用软毛刷直接洗涤，流水冲洗后再蒸馏水冲洗，烤干后高压灭菌．

使用过的９６孔板流水冲洗，６ｍｏｌ／Ｌ尿素溶液浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水冲洗，硫酸溶液浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水冲洗。烤干后紫外线照射过夜。

国内目前使用的大多为下排式高压蒸汽灭菌器，具有快速、可靠、无毒、无害、经济等优点。凡能耐高温，高湿的物品均可采用此法灭菌。物品高压灭菌时，在压

力０．１ｌ【Ｐａ，蒸汽温度１２１℃的情况下，橡胶类物品的高

压灭菌时间为１５Ｉｌｌｉｎ，敷料类物品的高压时间为４５

ＩＩｌｉｎ，

器皿类物品的高压时间为１５１１１ｉｎ，器械类物品的高压时

间为ｌＯｎｌｉｎ。瓶装溶液类物品的高压时间为３０ＩＩｌｉｎ。。须

特别说明的是，细胞培养用液不宜用干、湿热法灭菌。故实验室内还应配置不锈钢滤器来保持培养用液的无

菌。

高质量的蒸馏水在细胞培养工作中是必不可少的，实验室可根据工作的需要不同，分别用单蒸器或双蒸器烧制，不同纯度的纯化蒸馏水，细胞培养最好是使用玻璃蒸馏器烧制３次的蒸馏水配制各种溶液。纯水的最低要求是含氯化钠不多于０．４ｘ

ｌ矿，含内毒素水平每毫升

不高于１０单型２】，存放时问一般不要超过ｌ周，最好是现

配现用．

实验室的工作规则：每个进入细胞室的工作人员应保证其个人卫生。进入缓冲间时，应更换洁净的工作服和拖鞋，进入培养室时须戴帽子和口罩。如果做原代培养，工作服应消毒。第一个进入培养室的人员及时开启空气净化装置，最后离开人员关闭空气净化装置。每天实验前必须紫外线常规消毒ｌｈ（包括洁净台）。每周１次卫生消毒工作，包括地面、培养箱、桌面等其他部位。每月一次全面清洁工作，包括地面、桌面、培养箱、洁净工作台等。每周一次空气细菌培养检查（包括地面、洁净台、培养箱、工作人员手指）。

２．２

问题２的讨论

细胞培养的基本条件：培养液：迄今为止，人工合成

的培养基已有多种，如ＲＰＭＩ一１６４０，Ｅａ９１ｅ’ｓ№Ｍ、

ＤＭＥＭ、Ｈ锄’ｓＦ１２等，其主要差别在于氨基酸、维生素、

无机盐和能源物质的组成及含量不同．一般认为【３１’

时ＩＭＩ一１６４０营养全面，对各种组织生长都适用；Ｅａｇｌｅ’ｓ

ＭＥＭ适合于细胞株的传代培养；ＤＭＥＭ有利于细胞的

分裂增殖；Ｈ锄’ｓ

Ｆ１２能促进细胞的分化。也有学者将

不同培养基混合应用，从而得到较好的培养效果。

血清：淋巴细胞对血清的要求较高，所以选用血清时要注意生产厂家．但胎牛血清价格昂贵，新生小牛血

舱胁Ｊ撕阳嗍ｇＪＪＯＤＤ－啦，拈嬲，＠辄咖

５７４０

甘露．等．细胞培养技术

清或小牛血清也价格不菲，而使用自身血清不仅细胞长得好，而且更接近体内环境，避免了外来因素的干扰，使实验设计更严密。我们发现，当培养基中血清的浓度在１５％一２０％时细胞生长比较好，当超过３０％时反而不利于细胞生长。保证小牛血清的质量是细胞培养的关键．血清中含有多种促进细胞生长的因子．质量好的血清应该是无溶血、橘黄色清亮透明、无细菌、无支原体污染的粘稠状液体【４１．一般保存于一２０℃以下，时间不易过长．

ｐＨ值：细胞生长的最适ｐＨ为７．Ｏ．７．２，可忍耐的ｐＨ

范围为６．６—７．８，当ｐＨ低于６．８或大于７．６时，都会抑制细

胞生长【５１。作者发现，ＲＰＭｌｌ６４０培养基加入血清后ｐＨ值一般升高Ｏ．２加．４，敌配１６４０培养液及其他用液时使ｐＨ值达到７．２比较合适，并且需经常检测ｐＨ值。

培养空间：培养液与液面上的空间二者的体积比例

一般以１：１０为宜，培养液液面高度最好维持在２—５衄

的范围，以便于气体交换。

恒温培养箱：每天观察二氧化碳压力表，及时更换二氧化碳钢瓶，同时应有备用二氧化碳钢瓶。培养箱应划分不同区域，不同细胞应放不同区域，其他人不许动用，有的培养箱有高温消毒功能，

非管理人员不要动

此功能键，以免造成某些元件烧毁。恒温培养箱的温度应维持在３７℃，Ｃ０２浓度为５％，０２为９５％，１００％的饱和湿度。

细胞分散比率：在细胞生长的外部条件完全相同的情况下，细胞分散比率不同，会导致不同的增殖倍数，影响细胞产量，这对培养种细胞尤其重要。

转速：离心机以水平式的为宜，转速不宜过高，一般规律是慢速比快速好，变速培养比匀速培养好，先慢速后快速更好。转速的这种变化能使尽可能多的活细胞有更多的贴壁机会，且贴壁均匀一致．不同的转速组合其细胞产量可相差１５％。

冻存复苏：冻存复苏后的状态主要与冻存保护剂的种类、浓度、以及细胞复苏方法和复苏后培养液中小牛血清浓度等有关【６１．二甲基亚砜是一种分子量小、具有非常强的溶解能力和非凡渗透能力的化学物质，也是应用最广泛的体外培养细胞冻存保护剂ｒ７１，其常用浓度为１０％一２０％，不同种属细胞的最适浓度也存在一定差别，

例如，１０％二甲基亚砜浓度对长期冻存硒６２细胞较为适

宜。

原代细胞培养：组织块的分离方法：分为非酶消化法和酶消化法。非酶消化法包括：直接分离法，直接分离法可分为机械法和ＥＤＴＡ螯合法；组织块培养法．酶消化法包括：胰酶消化；胶原酶消化．

直接法分离得到的细胞较酶法低，但可满足一般实验的要求，优点是操作流程短，不需要复杂的仪器和昂贵的胶原酶【８】．组织块培养法多用于新生动物或动物胚

万　

方数据胎的肝细胞培养【９】．胰酶消化法具有分离效果好，操作简单和酶价格便宜的特点，但未被广泛应用，因为胰酶消化的条件很难掌握【ｌｏ】。改良的柠檬酸钠一胰酶消化ＢＨＫ２１细胞连续传代超过百代，细胞形态一致，活力良好．将柠檬酸钠一胰酶用于牛、羊睾丸，地鼠肾和鸡胚等原代细胞的制备都取得了良好的结果．胶原酶消化法具有分离效果好、细胞产量高，即时存活率高、对细胞损伤小，维持细胞特异性功能的时间长等优点。

单层细胞培养：将取下的组织块无菌剪切，或用机械法分散后，用０．２５％胰酶消化，使细胞分离，再用无菌Ｈ锄ｋｓ液或０．８５％ＮａＣｌ溶液洗涤后，置培养皿或培养瓶中培养．

悬浮培养：悬浮培养的细胞多取材于血液或体腔液，一般采用离心法分离细胞，低速５００—ｌ０００ｒ，ＴＩＩｉｎ离

心５一ｌＯＩＩｌｉｎ即可．培养时，只要取适当浓度的细胞悬液

接种于完全培养液中，细胞就能增殖．

传代细胞培养：细胞在原代培养１４周后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，影响细胞的生长繁殖【１１１．

贴壁型细胞的传代：传代时需要用胰酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用ＥＤＴＡ溶液与胰酶按１：ｌ或１：２比例混合后联合使用．过滤除菌后，小量分装，保存与一２０℃。消化时吸去培养瓶内的培养液，加入适量的ＥＤＴＡ溶液与胰酶的混合液，以能覆盖细胞层为度，将培养瓶平放，３７℃作用３—５ＩＩｌｉｎ，加入Ｈ狮ｌ【ｓ液，

ｌ０００ｒ，ｍｉｎ离心５

Ｉｎｉｎ即可除去消化液，洗ｌ一２次后加入

完全培养液，计数，置培养皿或培养瓶中培养【协１８】．

悬浮型细胞的传代：传代时用吸管将细胞吹打均匀，特别是一些成团生长的细胞，应将细胞团块打散。根据细胞生长状况的不同，用吸管将细胞悬液吸去适当的量，然后再加入完全培养液至原体积．

２．３

问题３的讨论紫外线灯：人的眼睛及皮肤长时间

暴露在紫外线下，会造成损伤，因此操作者必须注意，以免由于误照而引起电光性眼炎【１９】．因此，应加强工作人员的岗前教育，并将预防电光性眼炎的知识作为常规的培训内容进行指导。紫外线灯在消毒时可产生臭氧，臭氧可刺激人的呼吸道黏膜，臭氧过多时也可引起中

毒，臭氧的浓度不能高于ｏ．３

ｍ咖３，其预防方法为使用

无臭氧紫外线灯或消毒完３０ＩＩｌｉＩ诟，再进入消毒室进行操作，以防止不必要的损伤发生。灯管应保持清洁，积尘、多尘影响紫外线照射，可定期每周用９５％乙醇擦拭紫外线灯管表面，每日定时湿式拖地降尘。

离心机：细胞培养用的离心机普遍带有离心管套

管，平衡时应带上套管，一台离心机的套管只能在该离心机上使用，不能在离心机之间混用．平衡后的一对离心管及其内容物应对称放置，不能错位，不能装载单数的管子，以免因离心所产生的离心力不对称而损坏离心

５７４ｌ

２尼２”一龋ｗ一

轴．

污染：污染仍是细胞培养失败的主要原因，包括细

菌和真菌，中药制剂尤易出现真菌污染。支原体污染不易发觉，但对细胞生长影响较小，尤其只培养７２ｈ。一般是分离过程中的用液和培养基出现了污染，应在培养液中加入适量的抗生素，常规加入青霉素和链霉素各

１００Ｉ

ｙ，ｍＩ，。一旦发现杂茵污染，应及时处理以防蔓延，

常用的方法是将污染孔内液体吸尽，再滴加几滴灭菌硫酸铜。真菌污染可用抗真菌药达克宁注射液，有效成分为咪康唑。在细胞培养过程中，使用的小牛血清是造成支原体初级污染的主要来源。另外操作者的鼻咽腔及细胞培养的原始组织也可能有支原体寄生。但是次级污染源，即已污染支原体的细胞在污染的传播中更为重要，故要保证培养细胞的来源绝对干净，同时应做好检测，一旦发现支原体污染就应废弃，严禁已知污染了支原体的细胞进入未污染的工作区域。对每批小牛血清严格检查，灭活、过滤有利于抑制支原体的污染。

ｐＨ值：细胞在生长过程中，随着数量的增多和代谢活动的加强，不断释放Ｃ０２，使培养液变得过酸，ｐＨ值下降，为了维持培养液中ｐＨ值的恒定，常需在培养液中添加一定量的ＮａＨＣ０３，通常在ｌ

０００ｍＬＲＰＭＩ．１６４０

合成培养液中加入２ｇＮａＨｃ０３，另外Ｃ０２培养箱不稳定，过高或过低，或培养过程中瓶塞不紧，Ｃ０２逸出，导致ｐＨ值上升．

诱导剂：淋巴细胞在体内外一般是不分裂的，在培养过程中须添加刀豆球蛋白（ｃｏｎＡ）脂多糖（ＬＰｓ）、白细胞介素２（ｍ一２）、植物血凝素（ＰＨＡ）、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质，须注意它们的浓度及是否失效．

培养器皿洗涤不干净，有蜡、油污或酸残留。所有用于细胞培养的器皿，必须严格按要求洗涤，且洗涤后要求三蒸水或双蒸水充分冲洗５一１０次，方可灭菌使用。

培养用液含有杂质：配制过程中所使用的各种溶液必须用三蒸水㈣，若含有Ｆｅ、Ｃａ等离子及杂质，可影响细胞的增殖。

５７４２

万　

方数据甘露．等．细匏培葬技术

接种的细胞数目过多或过少，或提取的淋巴细胞中

混有大量红细胞。

存在个体差异：在相同条件下，某一受试者的血培

养不成功，而对照实验培养结果正常，其原因有时无法

查出。我们还发现，淋巴细胞的生长情况，还与受试对象的年龄有关，青年人的淋巴细胞比中、老年人的生长得要好。３参考文献

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细胞培养技术

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

甘露， 张志辉， 吕美娜， 王琳

甘露,吕美娜,王琳(白求恩军医学院仪器中心,河北省石家庄,市050081)， 张志辉(解放军陆军指挥学院门诊部,河北省石家庄市,050084)

中国组织工程研究与临床康复

JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH2008,12(29)4次

参考文献(20条)

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本文读者也读过(6条)

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2. 《中国组织工程研究与临床康复》杂志社学术部 细胞培养技术与软组织构建[期刊论文]-中国组织工程研究与临床康复2010,14(28)

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引证文献(4条)

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