产纤维素酶霉菌的筛选及初步鉴定
4881（2011）03-0006-03文章编号：1009-DOI：10．3969/j．issn．1009-4881．2011．03．002
产纤维素酶霉菌的筛选及初步鉴定
陈
燕，王小芬，金
伟，胡申才，曾
驰
（武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉430023）
摘
要：在长期有腐烂植物的潮湿处采集8种样品，用羧甲基纤维素液体培养基富集培养，分
离得到34株产纤维素酶的霉菌。利用刚果红染色法对所得菌株进行染色并以水解圈/菌落直
径大小为筛选标准进行初筛，得到11株菌。再用DNS法测定初筛所得菌株发酵液中纤维素
wx1005，酶的活力，得到两株纤维素酶活性较高的菌株wx0503、其发酵液纤维素酶活力分别可47．46U/mg。此外，达31．31U/mg、用苏丹混合液染色法对初筛所得到的产纤维素酶菌株染
wx1007。色，镜检观察其产油脂情况，得到2株产油量较大的纤维素酶产生菌株wx0403、关键词：纤维素酶；真菌；酶活；油脂
中图分类号：Q939．96
文献标识码：A
Screeningandcharacterizationofcellulase－producingfungistrains
CHENYan，WANGXiao－fen，JINWei，HUShen－cai，ZENGChi
（SchoolofBiologyandPharmaceuticalEngineering，WuhanPolytechnicUniversity，Wuhan430023，China）Abstract：Inthisstudy，eightsampleswerecollectedfrommoistenvironmentswithplantsdecaying，inwhichthirty－fourcellulase－producingfungistrainswereisolatedthroughenrichmentculturingbyCMC－Naliquidmedium．Thesecellulase－producingfungistrainswerethenscreenedusingcongoredstainingandelevenstrainsproducingbighydrolysiscirclewereselected．Subsequently，theDNSmethodwasemployedtoscreentheselectedstrains．Twostrains，wx0503andwx1005，wereshowntoproducethehighestcellulaseactivity，whichwere31．31U/mgand47．47U/mg，respectively．Besides，sudanmixturestainingwasperformedtoevaluatetheoilproductionbythecellulase－producingstrainsandtwostrains，wx0403andwx1007，wereselected．Keywords：cellulase；fungi；enzymeactivity；oil4糖苷键连接纤维素是由葡萄糖残基以β－1，［1］
而成的高分子聚合物。纤维素是生物圈里最丰富的有机物质，是植物细胞壁的主要成分，也是绿色
［1］
植物光合作用的主要产物。全世界每年产生的纤维素大部分以焚烧的形式处理掉，这不仅造成大量资源的浪费还造成环境污染。纤维素完全降解后
的产物葡萄糖是食品、饲料、燃料和化学原料的重要
来源。假如人类掌握了经济的水解纤维素的技术，不但可以提高纤维素的利用率，而且还可以减少森林工业、农业、造纸工业、木材加工业以及纺织工业所产生的废料对自然环境的污染。近几年来，随着人口增长、粮食短缺、石油危机的出现，将纤维素水
04-08．收稿日期：2011-E－mail：541565140@qq．com．作者简介：陈燕（1990－），女，本科生，
E－mail：zeng_chi@yahoo．com．cn．通讯作者：曾驰（1980－），男，讲师，
基金项目：湖北省教育厅科学项目（B20111701）；武汉工业学院校立科研项目（2009Q08）；武汉工业学院校级大学生创新性实验计划
项目（CX200909）．
解为小分子单糖再通过微生物发酵生产各种有用的
［1］
产品显得尤为重要。
纤维素酶是将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖
［2］
又称纤维素酶系。纤维素酶的的一种复杂酶系，
来源也很广。大多数纤维素酶主要来自种类繁多，
［2］
微生物体。目前，人们对各种微生物（包括真菌和细菌）的纤维素酶的关注较多，尤其是源于真菌的纤维素酶。所有能分解微晶纤维素的真菌，均能或多或少地分泌纤维素酶，所以纤维素酶的真菌源非常广泛。而真菌中的霉菌由于纤维素酶产量高、活性高，因此成为目前纤维素酶的主要生产菌［2］
种。发展具有自主知识产权的产纤维素酶霉菌菌种是近年来的研究热点。
本研究使用羧甲基纤维素液体培养基富集培养
分离得到34株产纤维素酶的霉菌。使用环境样品，
得到2株纤维素酶刚果红染色初筛和DNS法复筛，
wx1005。同时还使用苏活较高的霉菌菌株wx0503、
丹混和液染色检测初筛所得到的产纤维素酶菌株，
筛选得到2株纤维素酶活与产油量均较高的霉菌菌wx1007。株wx0403、
染色30上加入浓度为0．5%的刚果红溶液3mL，
，1mol/L的NaCl溶液彻底洗去染液，再用5%（m/v）的醋酸固定颜色。若霉菌产生纤维素酶，则在菌落的周围会出现清晰的透明圈。以透明圈直径与菌落直径之比的大小为参考指标对菌株进行初筛：比值大的证明该菌株的纤维素酶产量高；反之，则证明该菌株的纤维素酶产量低，可以将其剔除掉。
1．4可降解纤维素真菌的复筛
将参照菌株及初筛获得的纤维素钠水解圈/菌
28落直径比值较大的菌株接种到PDA培养基上，℃培养4—5d进行活化，之后接种到30mL（250
mL三角瓶）PDA液体培养基中，180r/min于28℃、3d后取样测定上清发酵液中的CMC下摇床发酵，酶活力。1．5
DNS法测CMC酶活
本实验将酶活力定义为：在适当的温度和pH值条件下，每1min水解相应的底物转化成1mg还原糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）。方法：在
2mL的CMC液（浓试管中加入0．2mL的粗酶液，
40℃度为1%）和2mL的醋酸缓冲液（pH为4．8），水浴1h。接着往试管中加入DNS显色液2mL，再
放进沸水中水浴10min，然后定容到15mL，最后用分光光度计测其在540nm下的OD值。
计算纤维素酶类的活性单位依据以下公式：
（bx+a）×n×1000
（U/g）．纤维素酶活力=
0．2×Ta：由葡萄糖浓度和式中x：样品OD值的平均值；b、
相应的OD值通过回归方程求得；n：酶液的稀释倍数；T：酶促反应的时间；0．2：所加酶液的量。1．6产油脂的纤维素酶产生菌检测
近几年来产油微生物的研究越来越引起人们的
那么它关注。如果一株菌既产纤维素酶又产油脂，的应用价值将会大大提高。因此本文也对筛得的产
纤维素酶真菌进行了产油脂的检测。所用的方法为苏丹混和液染色法
［5］
1
1．1
材料与方法
样品、参照菌株、培养基与试剂
样品：采集不同来源的10份样品，编号（来源）
wx02（钟祥棉秆）、wx03分别为wx01（钟祥竹林）、
（钟祥柴堆）、wx04（钟祥稻草堆）、wx05（枣阳树
wx06（枣阳柴堆）、wx07（武汉土豆）、wx08（武林）、
wx09（武汉生菜）、wx10（武汉芹菜）。汉茶叶）、
020408，参照菌株：020219，本实验室保藏。
［3］
培养基：PDA培养基、羧甲基纤维素培养［4］
基。如配固体培养基则另外添加总重1．5%的琼
脂粉。
NaCl脱试剂：刚果红染色试剂（刚果红染色液、
［5］
DNS法测羧甲基纤维素钠发酵液酶活力色剂）、
［4］［5］
所用试剂、苏丹混和染液。1．2样品采集、产纤维素酶真菌的富集与分离
。
在湿润且含有大量腐烂植物的环境采集样品，接
－6－6
种到加有青霉素（100×10）和庆大霉素（20×10）28℃摇床培养。将的羧甲基纤维素钠液体培养基中，
培养液系列稀释后涂布PDA固体培养基平板（加入
－6－6
庆大霉素20×10，青霉素100×10抑制细菌生
28℃培养2—3d，长）上，分离得到霉菌菌株。
苏丹混合液染色法：取PDA液体培养基发酵培
养的菌丝少许，置10mL小烧杯中，吸干液体培养基，加人苏丹混和液1—2mL于室温染色5min，取出菌丝于水中洗涤5min，挑取菌丝制作临时装片，镜检观察。根据油滴颗粒大小及密集程度作出产油
同时作好菌丝体形量（以+来评价产油量）的评价，
转态的观察记录。对镜检评价为++以上的菌株，
入斜面培养基上，冷藏保种。
1．3可降解纤维素真菌的初筛方法（刚果红染色）向长有霉菌的羧甲基纤维素钠固体培养基平板
2
2．1
结果与分析
富集培养，经分离纯化后共得到34株产纤维素酶的霉菌。所得的菌株如表1所示。
可降解纤维素霉菌的分离
将采集的样品接种到CMC－Na液体培养基中
表1分离得到的可降解纤维素霉菌
样品
wx012
wx022
wx036
wx043
wx053
wx064
wx071
wx082
wx094
wx107
分离出的菌株数
2．2刚果红初筛的结果2．5菌株形态观察
刚果红法是目前公认的鉴别真菌是否产纤维素
［5］
酶的有效方法。刚果红染色初筛得到生长迅速且透明圈直径/菌落直径大的菌株有wx0101、wx0305、wx0402、wx0503、wx0602、wx0603、wx0604、wx0904、wx1005、wx1006、wx1007，共11株。2．3DNS法测定粗酶液中CMC酶活力的大小将初筛得到的菌株用PDA液体培养基进行发酵，用DNS法测定发酵液的CMC酶活力，发现菌株wx0503、wx0603、wx1005等菌株的酶活力都比实验室保存的参照菌株020219和020408大。结果见表2。
表2纤维素酶活力
菌株酶活/U/mL
[1**********]8wx0503wx0603wx100516．94
14．98
31．31
23．3
47．46
——对筛得的纤维素酶活力最高的2株菌株—
wx0503和wx1005、纤维素酶活与产油量均较高的2——wx0403和wx1007进行显微镜观察并拍株菌株—照，结果见图1。从图片中可以清晰地看见纤维素酶活与产油量均较高的2株菌株菌丝间有大量的黄色油滴
。
2．4产油脂检测
对刚果红初筛的菌株进行产油脂的检测，并对产油情况进行评价。评价结果如表3。油滴多少分++、+、＜+表示。别以+++、
表3菌株产油脂检测结果
菌株wx0101wx0202wx0303wx0304wx0401wx0402wx0403wx0502wx0503wx0601wx0602wx0603wx0604wx0904wx1005wx1006wx1007
评价++++＜++＜+++++++++++++++++++
图1菌株形态观察
3讨论
——并不是在CMC本研究中观察到一种现象—
－Na培养基上长的最好（就是菌落直径最大）的菌
DNS法所测得的纤维株其刚果红染色水解圈最大，
素酶活力最高，可能的原因是有些菌所产生的纤维
素酶为胞内酶。这对酶活力是一个很好的解释，但用于解释刚果红染色水解圈就有些牵强了。
研究中还遇到另一个问题：在用刚果红做染色鉴定时，我们首先尝试将能在CMC－Na培养基上生长的菌直接接种到纤维素－刚果红培养基（配方（NH4）2SO42．0g，MgSO4·7H2为：CMC－Na2．0g，
O0．5g，K2HPO41．0g，NaCl0．5g，刚果红0．4g，水1000mL，琼脂20g）平板培养。结果所接种的菌大
（下转第13页）
4结论
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3258－3259．
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［9］郑云，蔡木易，范慰慰．蛋清白蛋白酶解工艺
J］．食品与发酵工业，2005，31（12）：的研究［
69－71．
本试验以新鲜鸡蛋蛋清为原料，探讨了碱性蛋白酶对蛋清的酶解效果。由于蛋清蛋白结构致密，因此需要进行一定的预处理，使之形成蛋白酶作用的状态。本试验所选出的最佳变性条件为沸水浴加热处理15min。通过单因素试验和正交试验，得到碱性蛋白酶酶解蛋清的最佳工艺条件为：底物浓度4%，pH值9．5，酶解温度55℃，加酶量6%，酶解时间4h。
参考文献：［1］金嫘，王晶，李新华．Alcalase碱性蛋白酶酶
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（11）：14－15．
［3］MartaMiguel，RosinaLopez－Fandino，Merce-desRamos，etal．Longtermintakeofeggwhitehydrolysateattenuatesthedevelopmentofhyper-
（上接第8页）
部分无法生长，有生长的菌株也没产生预期的明显
的水解圈。因此我们设计了2组平行实验，一组是将菌接种到纤维素－刚果红培养基（即在CMC－Na培养基配方中增加了0．4g/L的刚果红）固体平板上培养，另一组是将菌接种到CMC－Na培养基上，然后用刚果红染色法进行染色鉴定。理论上刚果红鉴定培养基和刚果红染色法均应看见水解圈，但实际上菌株在加了刚果红的培养基上的生长情况同纤维素－刚果红培养基，而后一种方案确实达到了预——菌株生长状况较好，期效果—经染色后也都出现了水解圈。原因可能是所加入的刚果红抑制了菌株对CMC－Na的利用，从而影响菌株的生长。参考文献：
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