动物细胞融合经典
动物细胞融合
【实验原理】
在诱导物(如仙台病毒,聚乙二醇)作用下,相互靠近的细胞发生凝集,随后在质膜接触处发生质膜成份的一系列变化,主要是某些化学键的断裂与重排,进而细胞质沟通,形成一个大的双核或多核细胞(此时称同核体或异核体)。
【实验目的】
1.了解PEG 诱导细胞融合的基本原理。
2.通过PEG 诱导鸡红细胞之间的融合实验,初步掌握细胞融合技术。
【仪器、材料及试剂】
1.仪器:显微镜 离心机 天平 离心管 注射器 细滴管 载片、盖片。
2.材料:一龄公鸡静脉血
3.试剂:Alsever 溶液、GKN 溶液、0.85%生理盐水、50%PEG溶液、双蒸水。
附试剂的配配制:
①Alsever 溶液:葡萄糖 2.05g ,柠檬酸钠0.80g ,NaCl 0.42g,溶于100ml 双蒸水中。 ②GKN 溶液:NaCl 8g,KCl 0.4g,Na2HPO4·2H2O 1.77g,NaH2PO4.H2O 0.69g,葡萄糖 2g ,酚红 0.01g ,溶于1000ml 双蒸水中。
③0.85%生理盐水
④50%PEG溶液:称取一定量的PEG (WM=4000)放入烧杯中,沸水浴加热,使之熔化,待冷却至50℃时,加入等体积预热至50℃的GKN 溶液,混匀,置37℃备用。
【操作步骤】
1.在公鸡翼下静脉抽取2 ml鸡血,加入盛有8 ml的Alsver 液中,使血液与Alsver 液的比例达1:4,混均后可在冰箱中存放一周。
2.取此贮存鸡血1ml 加入4ml 0.85%生理盐水,充分混均,800rpm 离心3min ,弃去上清,重复上述条件离心两次。最后弃去上清,加GKN 液4ml ,离去。
3.弃去上清,加GKN 液,制成10%细胞悬液。
4.取上述细胞悬液以血球计数器计数,用GKN 液将其调整为1×106个/ ml。
5.取以上细胞悬液1 ml于离心管,放入37℃水浴中预热。同时将50%PEG液一并预热20min 。
6.20min 后将0.5ml 50%PEG溶液逐滴沿离心管壁加入到1 ml细胞悬液中,边加边摇匀,然后放入37℃水浴中保温20min 。
7.20 min后,加入GKN 溶液至8ml ,静止于水浴中20 min左右。
8.800rpm 离心3min ,弃去上清,加GKN 溶液再离心1次。
9.弃去上清,加入GKN 液少许,混均,取少量悬浮于载玻片上,加入Janus green染液,用牙签混均,3min 盖上盖玻片,观察细胞融合情况。
10.计算融合率,融合率=视野内发生融合的细胞核总数/视野内所有细胞核总数×100%。
【实验报告】
1.简述动物细胞融合的基本过程;
2.选一理想视野,根据镜下结果绘图,并以上面公式计算融合率。