甘薯花青素的提取及其抑菌效果分析

中国农业科学 2005,38(11):2321-2326 Scientia Agricultura Sinica

甘薯花青素的提取及其抑菌效果分析

王关林，岳 静，李洪艳，方宏筠

（辽宁师范大学生命科学学院，大连116029）

摘要：建立了甘薯块根花青素（sweetpotato anthocyanin,SPAC）的大孔树脂吸附制备技术，分析了其抑菌作用和机理。结果表明，在0.8%柠檬酸、物料比1∶200，60℃温水浴提取2 h 的条件下可获得最大的提取率3.81 mg ·g -1。 粗提物经AB-8大孔树脂过柱纯化后可获得色价为225.1E 的纯品，色价提高6倍。研究发现SPAC 对3种常见致病菌均有抑菌作用，并与其浓度呈正相关。通过电镜观察、SDS-PAGE分析及生长曲线比较表明，SPAC抑菌机理是通过SPAC 与细胞中的蛋白或酶结合，使其变性失活，抑制对数生长期的细胞分裂，而后使细胞质固缩、解体，导致细胞死亡。SPAC具有色素和抑菌双重功能，是理想的功能性天然色素。

关键词：甘薯；花青素；提取；抑菌

Extraction of Anthocyanin from Sweetpotato by Macroporous Resin

and Its Bacteriostatic Mechanism

WANG Guan-lin, YUE Jing, LI Hong-yan, FANG Hong-jun

(College of Life Science,Liaoning Normal University, Dalian 116029)

Abstract : The extraction technology by using adsorption of macroporous resin and the bacteriostatic mechanism of anthocyanin from sweetpotato were studied in an experiment. The results showed that the maximum extraction rate of anthocyanin from sweetpotato 3.81 mg·g-1 was gained on the optimal extractive conditions of 0.8% citric acid, the material to solvent ratio of 1: 200, 60o C homothermal bainmarie, 2 hours extraction time. The high purity extracts with 225.1E colour value ( E1%1cm 532nm ) was obtained through purification by using AB-8 macroporous resin’s adsorption, which was six times as the crude extracts. The inhibitory effects of anthocyanin from sweetpotato on growth of E.coli , S.aureus and P.aeruginos were discovered, and showed a positive correlation with the concentration of anthocyanin from sweetpotato. Observation under transmission electron microscope, SDS-PAGE analysis and comparing growth curves of normal E.coli affected by anthocyanin from sweetpotato indicated that the bacteriostatic mechanism was the combination of anthocyanin from sweetpotato with protein or enzyme in the cell and inhibiting cell division, then cell died caused the concentration and disintegration of cytoplasm. The anthocyanin from sweetpotato possesses two functions of pigment and bacteriostatis and it is a perfect natural pigment.

Key words: Sweetpotato (Ipomoca batatas. L.); Anthocyanin; Extraction; Bacteriostatic

在发现合成色素对人体的累积性致畸和致癌作用后，使用天然色素取代合成色素势在必行[1]。目前市售的天然色素价格昂贵，尤其是日本等发达国家一直居高不下。因此，寻找一种优质高产、价廉的天然色素资源是生产的迫切需要。紫甘薯不仅富含天然红色素，而且具有抗病、抗旱、价廉等优点，是一种很好的天然色素原料。对紫甘薯色素已有许多研究，其主要成分是甘薯

花青素，无毒无味 [2]，并且具有抗氧化和保健功能[3]。其常规的提取工艺也已建立[4]，但利用大孔树脂吸附制备技术的报道甚少。本研究发现甘薯花青素还具有很好的抑菌效果。为加速紫甘薯色素的开发利用，本论文旨在建立更简便有效的甘薯块根花青素（SPAC ）制备技术，明确其抑菌作用和机理。

收稿日期：2004-11-05

基金项目：辽宁省科技攻关项目（01-02-08） 作者简介：王关林（1943-），男，教授，博士，主要从事植物基因工程研究。Tel: 0411-84258779; Fax: 0411-84212515; E-mail: [email protected]

2322 中 国 农 业 科 学 38卷

1 材料与方法

1.1 材料

甘薯品种（山川紫Ipomoca batatas L . cv. Ayamurasaki ）由辽宁省生物工程重点实验室提供。AB-8大孔树脂由天津南开大学化工厂生产。金黄色葡萄球菌（S . aureus ）、绿脓杆菌(P . aeruginos ) 、大肠杆菌(E . coli )由中国医学菌种保藏中心提供。 1.2 方法

1.2.1 SPAC的提取 取新鲜山川紫块根洗净，将紫甘薯粉分别溶于以下各种不同浓度的溶剂中：Ⅰ：0.2% Ⅲ：0.2% HCA；Ⅳ：95% EtOH；HCl ；Ⅱ：0.2% C6H 8O 7；Ⅴ：0.2% HCl+95% EtOH；Ⅵ：0.2% C6H 8O 7+95% EtOH；Ⅶ： 0.2% HCA+95% EtOH；Ⅷ：1% MtOH-HCI；Ⅸ：H 2O 。在60℃下提取2 h，4 000 r/min离心10 min，取减压浓缩至原体积的1/10保存，上清液，测定A 532nm 值，为SPAC 粗品。 1.2.2 单因素试验

（1）柠檬酸浓度及料液比的选择。 测试柠檬酸浓度时精确称取8份紫薯粉，每份10 g，分别溶于0.1%～1.2%的柠檬酸溶液各1 000 ml中，取上清液，测定A 532nm 值，并计算提取率。测定料液比时精确称取5份紫薯粉，每份10 g，分别溶于500 ml～4 000 ml的 0.8% 柠檬酸溶液中，以同样方法提取。

（2）提取温度和时间的选择。精确称取5份紫薯粉，每份10 g，分别溶于1 000 ml 0.8% 的柠檬酸溶液中，在20℃～100℃下恒温水浴提取30 min～5 h不等。 正交1.2.3 正交试验选择提取条件组合 用L9（34）表[5]安排试验。4因素及3水平设置如下：温度 20℃、40℃、60℃，时间1 h、2 h、3 h，物料比（w/v）1∶200、1∶100、1∶50及柠檬酸提取液浓度（w/v）0.4、0.8、1.2。

1.2.4 SPAC的纯化 将100 ml SPAC浓缩液上柱，以40 d·min-1流速通过树脂层。待色素充分吸附后，用pH 2.6 Na2HPO 4·柠檬酸缓冲液以同样流速洗脱约30 min ，然后用70% 的EtOH 以同样流速洗脱，收集色素部分，至流出液变为无色后停止收集。将收集好的色素溶液减压浓缩，冷冻干燥。 1.2.5 提取率计算及色价的测定

（1）提取率计算。 以合成苋菜红为基准物，制作苋菜红标准曲线，计算SPAC 提取率[6]。

提取率P （mg·g-1）= Y×V×W-1 Y 为提取液体积，W 为样品重；

产率P （mg·g-1）= WSPAC 制备物/WPSP × 100%。 （2）色价的测定。色价E 1%1cm 532nm = AV/100m A 为样品液的吸光度，V 为0.8%柠檬酸体积，m 为样品质量。

1.2.6 SPAC抑菌试验

（1）SPAC 对菌株的敏感性测试。采用牛津杯法[7], 测量抑菌圈大小。采用液体倍比稀释法测定MIC(最低抑菌浓度) 和MBC （最低杀菌浓度）。

（2）E.coli 生长曲线的绘制。SPAC 加入菌液中的并使每毫升菌液含菌体103～105终浓度为1.25 mg·ml-1，

个，继续培养并每隔1 h取样测A 532nm 值，绘制SPAC 作用后的E.coli 生长曲线。

（3）E.coli 菌体蛋白SDS-PAGE 电泳分析。 正常生长的E.coli 分对照组，SPAC1.25 mg·ml-1加药组，并于4 h、8 h分别取样5 ml。按常规方法进行SDS-PAGE 电泳[8]。利用凝胶成像系统的Gel-Pro Analyzer（Version3.1）蛋白分析软件，定量分析E.coli 胞体内可溶性蛋白含量的变化。

（4）电镜试验。将处于对数生长期的E.coli 为对照组，加入SPAC 1.25 mg·ml-1为加药组，培养4 h、8 h后分别取样，按电镜制样及超薄切片技术[9]操作，在日立H700电镜下观察、照相。

2 结果与分析

2.1 溶剂种类及浓度对SPAC 提取率的影响

从图1的结果可见，1%盐酸甲醇的提取效果最好，提取率可达3.83 mg·g-1紫薯粉，但甲醇挥发性强，且具

Ⅰ-Ⅸ. 溶剂类型；（1）～（9）. 正交实验组编号 Ⅰ-Ⅸ. Solvents; (1)-(9). No.of orthogonal experiment

图1 提取溶剂种类及正交组合对SPAC 提取率的影响 Fig. 1 Effects of different solvents and orthogonal experiment

on sweetpotato anthocyanin (SPAC) extraction rate

11期 王关林等：甘薯花青素的提取及其抑菌效果分析 2323

有一定的毒性，不宜用作天然色素的提取剂。稀柠檬酸和稀盐酸的效果次之，其提取率分别为3.59 mg·g-1和3.46 mg·g-1。由于色素产品主要用于食品工业，因此，本试验采用0.8%柠檬酸作为SPAC 的提取剂（图2）。

的生长高峰。这表明，SPAC 主要抑制了E.coli 对数生长期的菌体分裂。

2.5 SPAC的纯化及其制备工艺

采用AB-8大孔树脂过柱吸附纯化后的SPAC ，样品色价大幅度增加，从37.5E 提高到225.1E ，纯化了约6倍。纯化提取率达到85.7%。根据上述试验结果，确定出SPAC 的制备工艺流程（图5）。

图2 柠檬酸浓度对SPAC 提取率的影响

Fig. 2 Effects of different citric acid concentrations on SPAC’s

extracting rate

图3 温度及时间对SPAC 提取率的影响

Fig. 3 Effects of different temperature and time on SPAC’s

extraction rate

2.2 料液比、温度及时间对SPAC 提取率的影响 2.2.1 料液比对SPAC 提取率的影响 在低料液比时，随着比值的增加提取率明显上升，到1∶200时迅速达到最高值。再提高比值时提取率无明显升高，甚至有下降趋势，因此其最适料液比为1∶200。

2.2.2 温度和时间对SPAC 提取率的影响 升温可以提高提取率，但温度过高反而会降低提取率，这可能因为原料受热，淀粉糊化，影响了提取剂对色素的溶解。所以SPAC 的最适提取条件为60℃，2 h。延长时间对SAPC 提取率的影响不大（图3）。 2.3 最佳提取工艺参数的确定

正交试验结果表明，最优水平组为第8组（图1）。其条件与单因素试验结果基本相符。因此，从紫甘薯中提取SPAC 的最佳工艺参数为：0.8%柠檬酸，料液比1∶200，温度60℃，提取时间2 h，提取率可达3.81 mg·g-1。

2.4 SPAC对E.coli 生长曲线的影响

图4示出，在3 h～8 h 为E.coli 的正常对数生长期，在含有1.25 mg·ml-1 SPAC （1MBC E.coli ）的培养基中其生长曲线发生明显变化：SPAC 作用4 h后，活菌数目开始下降；6 h后很快进入衰亡期，没有达到正常

图4 SPAC对 E.coli 生长曲线的影响

Fig. 4 Effect of SPAC on the growth curves of E.coli treated by

SPAC

2.6 SPAC对3种致病菌的抑制作用

图6示出，SPAC 对S.aureus 、P.aeruginos 和E.coli 有不同程度的抑制作用，并且随着SPAC 浓度增加抑菌圈明显变大。其中S.aureus 对SPAC 的敏感性最强， SPAC 0.625 mg·ml-1时抑菌圈仍很大。液体倍比稀释法测得SPAC 对3种敏感菌的MIC （mg·ml-1）及MBC 分别是S.aureus 为0.186和0.373，P.aeruginos （mg·ml-1）

为1.25和1.25，E.coli 为0.625和1.25。

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紫甘薯粉 中 国 农 业 科 学

浸膏粗品

38卷

色素液

在650mm Hg，45℃减压浓缩

Hypobaric, concentration under 650mm Hg, 45℃ Grude extract

Sweetpotato powder Pigment solution 1st exrtraction

残渣 Residual

AB-8

食品加工原料

AB-8 purification

冷冻干燥Freezed dry

SPAC 纯品 Pure SPAC

Materials for food process

图5 SPAC的制备工艺流程

Fig. 5 Procedure of SPAC manufacturing technology

S.aureus P .aeruginos E.coli

C: Normal saline (CK); 1: 0.8% citric acid solution (CK); 2: 0.625 mg·ml-1 SPAC solution; 3: 1.25 mg·ml-1 SPAC solution; 4: 2.5 mg·ml-1 SPAC solution; 5: 5 mg·ml-1 SPAC solution

图6 不同浓度的SPAC 对各指示菌的抑制作用 Fig. 6 Effect of SPAC concentrations on bacteriostatic inhibition

2.7 SPAC对E.coli 菌体蛋白SDS-PAGE 谱的影响

由图7的电泳图谱和表可以看出，与对照相比，含

1 2 3 4

有SPAC 的培养液中E.coli 菌体胞内可溶性蛋白含量发生明显变化：（1）蛋白总量低于对照，并随时间延长含量下降增大（2）在检测到的27条蛋白带中，含量发生明显变化的有6条，其中有4条为大分子蛋白（如R 3、R 4等）。大分子蛋白一般为重要的功能蛋白，这表明SPAC 通过影响细菌功能抑制来影响细菌增殖。 2.8 SPAC对E.coli 菌体超微结构的影响

透射电镜观察到正常的E.coli 菌体呈棒状，细胞壁完整、光滑，无质壁分离现象，细胞质、核致密均匀。经SPAC 作用4 h后，出现两种状态，一种状态是菌体变形，细胞质固缩，出现明显的质壁分离（图8）。随SPAC 作用时间延长，出现第二种状态，细胞质解体，形成小空泡，并连接成大空泡，成为空腔，细胞死亡（图9）。

R 1 R 3 R 4

1,3. Normal E.coli for 4, 8 h; 2,4. SPAC’s E.coli for 4, 6h, respectively

图7 SPAC不同时间E.coli 菌体内可溶性蛋白的变化 Fig. 7 The variance of soluble protein of E.coli

3 讨论

11期 王关林等：甘薯花青素的提取及其抑菌效果分析 2325

AB-8大孔树脂在本试验中反复使用20次，吸附能力基本不变，还可使用。Terahara 等[11]和陈勇等[13]最近有同类研究结果报道，可见AB-8大孔树脂是SPAC 的优良吸附剂。

3.2 SPAC抑菌作用的机理

透射电镜观察到SPAC 作用后E.coli 菌体出现严重质壁分离，细胞质固缩并解体成空泡、细胞致死。这表

明SPAC 与蛋白质结合反应。黄卫文等对中药抑菌研究中曾报道，认为皂甙类化合物与细胞蛋白结合成复合物SPAC 属苷类物质，可能有同样的作用机理。的作用[14]。

SDS-PAGE 分析表明，SPAC 作用菌体后大分子量蛋白的谱带的量明显减少，直至消失。进一步表明这些蛋白质主要是大分子蛋白。对SPAC 化学结构分析可知，SPAC 属类黄酮类化合物，其分子结构上有较多的酚羟基，这些官能团与蛋白质或酶通过氢键方式结合，破坏蛋白质分子结构而变性或失去活性，导致细胞质的固缩和解体 [15]。菌株的生长曲线分析中观察到SPAC 作用主要发生在对数生长期，即细胞分裂增殖期。因此可以推测这些蛋白或酶很可能与细胞分裂有关。

图9 SPAC作用后细胞质解体, 细胞死亡

Fig. 9 Cell died with cytoplasm disintegrating in effection of

SPAC

表 E.coli 菌体胞内部分可溶性蛋白含量的变化 Table Changes of the some soluble contents protein in E.coli

蛋白条带 Protein band

8 (ck)

时间 Time

8

图8 SPAC作用后细胞质壁分离

Fig. 8 Cell plasmolysis in effection of SPAC

4 结论

研究结果表明：采用柠檬酸乙醇萃取，AB-8大孔树脂纯化技术能有效分离提取紫甘薯中的SPAC ，并且是简单、有效、廉价的工艺技术；SPAC 不仅是理想的色素，而且具有抑菌作用，因此SPAC 作为食品添加剂有很好的应用价值。

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3.1 AB-8大孔树脂是SPAC 优良的吸附剂

目前对紫甘薯色素的提取主要采用酸性溶液分步提取法[10]，存在操作较复杂，成本较高等不足，特别是甘薯多糖的存在对色素纯化造成困难。AB-8大孔树脂在pH2.6时对色素的吸附能力最强而对多糖不吸附[11]。因此本研究利用该树脂能将粗提液直接过柱纯化，操作简单。纯品色价从37.5E 提高到225.1E ，产量达3.81 mg·g-1，比乙醇盐酸法产量0.175 mg·g-1[12]提高近20倍。

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38卷

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(责任编辑 王 芳，曲来娥)

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作者

王月福, 于振文, 李尚霞, 余松烈 姜东, 于振文, 李永庚, 余松烈

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