基础生物学论文2

浅论转基因大豆的发展

学 院：

专 业：学 号：姓 名：论文提交日期： 2012 12 月

摘 要

英文摘要

中文摘要

关键词：

目 录

第一章 背景介绍……………………………………1

第二章 大豆遗传转化再生体系研究…………………………2

第一节 不定芽器官发生再生体系……………………………2

第二节 体细胞胚胎发生再生体系……………………………………2

第三节 原生质体再生体系………………………………3

第三章 大豆遗传转化技术研究………………………………………3

第一节 农杆菌介导大豆转化法………………………………………4

第二节 基因枪转化法………………………………………4

第三节 花粉管通道转化方法…………………………………4

第四章 对转基因大豆未来的展望…………………………………5

大豆遗传转化存在的问题

参考文献

大豆［Glycine max( L．) Merrill］属于豆科、蝶形花亚科植物。是世界

上最重要的油料作物和高蛋白粮食作物之一，也是人类植物性蛋白和油脂的重要来源，而且是重要的家畜饲料和许多工业原料,在医学上也有很大价值。［1］。［1］ Somers D A，Samac D A，Olhoft P M． Recent advances in legume transformation［J］． Plant Physiology，2003，131: 892-899．

转基因技术可打破物种界限, 对基因进行定向改造、重组和转移, 在解决常

规育种技术难以克服的产量、品质、多抗等性状协调改良方面发挥了重要作用。

随着基因工程研究的深入,目前大豆转化效率最高可以达到 32．6%。尽管经

过 20 多年的研究，且转基因大豆的大田性状已经商业化,大豆转化效率不断提高，但与水稻 ( 转化率30% ) 、玉米( 转化率 41% ) 等农作物相比较，大豆转化率仍然较低，大豆仍然被认为是较难转化的作物之一［34］。［34］ Jürgen V D L，Manuel J，Javier M F，et al． In vitro glycation and antigenicity of soy proteins ［J］． Food Research International，2007，40: 153-160．

优点

与种植传统大豆相比，种植转基因大豆后，不仅可以有效控制杂草，明显减轻杂草危害，从而提高产量，节约劳力、节省田间管理时间；而且可以大大减轻除草剂药害，有利于轮作倒茬，培肥地力，建立良性循环的耕作栽培体系以及减轻环境污染。

大豆遗传转化再生体系研究

大豆再生体系建立的主要工作是进行原生质体和单细胞培养等大豆的组织培养研究,是大豆转基因研究的关键所在。目前大豆遗传转化的受体系统主要有不定芽器官发生途径，包括农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法;体细胞胚胎发生途径，包括子房注射法、花粉管通道法;原生质体途径, 包括聚乙二醇法、电击法、脂质体法。3，。。转基因技术在大豆育种中的应用

练 云1,梁慧珍1,余永亮1,王树峰1,位艳丽1,董 薇1,张孟臣2,蒋春志2 第30卷 第2期

2011年 4月

大豆科学

SOYBEAN SCIENCE

Vo.l 30 No. 2

1.1.1 不定芽器官发生再生系统

大豆不定芽器官发生体系所用的外植体包括无菌苗子叶节、未成熟种子的子叶和茎尖、无菌苗上胚轴、幼胚和小真叶等。不定芽器官发生系统中,外植体内已存在的分生组织和有分化潜力的表皮、亚表皮细胞都可作为遗传转化的靶组织。目前,大豆子叶节不定芽器官发生体系已经被公认为是较成熟、易行的大豆再生体系。但不同基因型由于遗传和生理差异,诱导植株再生效果不同。

以子叶节为代表的大豆不定芽再生体系的优点是:

(1)再生时间短,通常1~3个月就可获得生根的再生植株;

(2)外植体容易获得,不受季节限制;

(3)再生过程简单,只需愈伤组织诱导、丛生芽分化培养、芽伸长及生根培养几个步骤;

(4)再生频率高。

但是该再生系统最大的缺点是不定芽多数为多细胞起源,转化后一般为嵌合体,纯化、筛选的难度较大。另外,不定芽再生系统也存在外植体较大,以及外植体本身抗性对于转化后的筛选工作不利等缺点。

1. 2 体细胞胚胎发生再生体系

诱导外植体胚胎发生,形成体细胞胚,胚萌发发育成为完整植株,这种再生方式称为胚胎发生途径。1986年Barwale等报道了通过体细胞胚获得植株再生,大豆体细胞胚胎再生体系获得了初步成功[8]。[8]BarwaleU B,KernsH R,Widholm JM. Plant regeneration from ca-llus cultures of several soybean genotypes via embryogenesis and orga-nogenesis[J]. Planta,1986,167:473-481.大豆体细胞胚胎发生再生系统是目前大豆再生系统研究的一个重要部分,该再生系统有3个显著的优点[12]: [12]徐鹏飞,张淑珍,李文滨,等.大豆组织培养再生系统的研究进展[J].中国农学通报,2005,21(9):47-49,63.

(1)在1个培养物上所能产生的胚状体数目一般比不定芽数目多;

(2)胚状体形成速度快;

(3)胚状体结构完整。

但是体细胞胚胎发生再生系统也存在部分后代不育、传代时间长、再生植株常出现变异等问题,仍然需要进一步优化。

1. 3 原生质体再生体系

植物原生质体比较容易摄取外来遗传物质,是遗传转化的理想受体,为细胞水平、分子水平上的遗传操作提供了理想的实验体系。但实践证明,获得大豆原生质体再生植株十分困难,所以应用并不广泛。

2 大豆遗传转化技术研究

在转基因技术中,如何将目的基因高效稳定的

转移到受体中是最为关键的环节。由于植物分生组

织再生植株的能力差,现有的转化体系同植株再生

系统不能有效结合,因此,大豆遗传转化效率较低。根据植物遗传转化的原理,可以将植物遗传转化方法分为三大系统:载体转化系统,包括农杆菌介导法(根癌农杆菌Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒) 和植物病毒载体法;种质转化系统,包括花粉管通道法、胚囊和子房注射法、萌动种胚浸泡法;DNA 直接导入的基因转化系统,包括物理法(基因枪法、超声波法、电激法等) 和化学法(PEG法、脂质体法) [1] [1]李文霞,宁海龙,李文滨. 大豆遗传转化系统的研究进展[J ] . 中国农学通报,2005 ,12 (21) :67 - 71.。

目前应用最为广泛的是农杆菌介导外源基因转化,其中根

癌农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化系统最为常见

且效果最佳。大豆遗传转化技术在转基因大豆研究中的应用

王振华1 杨德光1 张辉2 胡正2生物技术通报

BIOTECHNOLOGY BULLETIN2010年第10期61

1.2.1 农杆菌介导法

1. 1. 1 农杆菌发展简介

土壤农杆菌( Agrobacterium tumefaciens)是普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。目前与植物基因转化有关的2种类型为:根癌农杆菌

(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobac-terium rhizogenes),分别含有Ti质粒和Ri质粒。转基因技术在大豆抗病毒育种中的应用研究进展

韩 阳1, 2, 3,王昌凌2,赖冰冰3江苏农业科学 2010年第1期118

在植物基因工程中,利用根瘤农杆菌介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌具有趋化性,侵染受体时,在植物受伤组织产生的一些糖类和酚类物质诱导下,向受伤组织集中,通过供体和受体特异互作,农杆菌细胞识别并附着到植物细胞表面,将分子克隆技术在农杆菌的Ti质粒(或Ri质粒)中的T-DNA区域插入拟转基因,通过农杆菌的感染将所带的T -DNA导入植物细胞,并将拟转基因整合进植物基因组。自 1983 年首次利用农杆菌介导法获得转基因烟草植株以来，在目前已获得的 200 多种转基因植物中，大约 85% 均来自于农杆菌介导转化法［36］，该方

法已成为植物遗传转化的首选方法［37］。 ［36］ 余永亮，梁慧珍，王树峰，等． 中国转基因大豆的研究进展及其

产业化［J］． 大豆科学，2010，29( 1) : 143-150． ( Yu Y L，Liang Z H，Wang S F，et al． Research progress and commercialization on transgenic soybean in china［J］． Soybean Science，2010，29 ( 1 ) : 143-150． )

［37］ Gelvin S B． The introduction and expression of transgenes in plants

［J］． Current Opinion in Biotechnology，1998，9: 227-232．

1. 1. 2 农杆菌方法的优缺点

此法具有技术简单成熟,耗资少,可靠性高,转化率相对较高, T-DNA 插入拷贝数低，结构简单，外源基因发生沉默的比例较低，可选用的外植体类型广泛，可以转移大片段外源基因( > 30kb) ,没有明显的基因重排现象,外源基因主要以单拷贝插入植物基因组等优点。

农杆介导的大豆转化的效率受到大豆基因型、组织培养条件、农杆菌菌株感染转化能力、T-DNA的转移效率和转化后的筛选模式，周期长、转化率低、稳定性和重复性差、基因型限制等突出问题,转化效果极大地依赖于物种、基因型、外植体以及其它一些未知因素的影响。优化遗传转化体系、提高其转化效率的研究工作一直在进行中。

农杆菌介导转化的过程主要包括几个步骤:

农杆菌积聚、vir 基因的诱导表达、T-DNA复合物的形成、T-DNA 转入并整合到植物基因组。由于农杆菌介导转化涉及农杆菌与大豆外植体之间的互作，因而筛选对大豆等豆科植物毒性较强的农杆菌菌株以及对农杆菌敏感的大豆基因型或外植体可以有效提高大豆转化效率。

1. 2. 1 基因枪转化法简介

基因枪转化法又称微弹轰击法(microprojectile bombard2ment) ,是最广泛地应用于一些对农杆菌不敏感的植物的转化方法。在这项技术中,DNA吸附在微载体(钨粉或金粉粒子)表面,然后以高压气体或高压放电为动力,金属微粒被射入受体植物细胞,实施转化。大豆遗传转化技术在转基因大豆研究中的应用

王振华1 杨德光1 张辉2 胡正2生物技术通报

BIOTECHNOLOGY BULLETIN2010年第10期技术与方法#61

1. 2. 2 基因枪转化法的优缺点

其优点是不受受体植物范围的限制,而且其载体质粒的构建也相对简单,对DNA 的转移过程与基因型的依赖性没有任何生物限制。因此能够产生微创有利于基因转移而具有相对较高的转化率,能够转移多拷贝的重组DNA 或者DNA 片段

[13 ] 。[13]武小霞,李文滨,张淑珍. 我国大豆转基因研究进展[J]. 大豆科学,2005,(2).

但基因枪介导法存在转化效率比较低,插入外源DNA的片段大小不明确,耗资大,技术难,转移DNA 分子量一般不高于10kb ,在植物基因组中拷贝数高,容易发生基因沉默现象,不利于外源基因在宿主植物的稳定表达等缺点,而且成本高,操作比较复杂,在实际应用中有一定局限性。

1. 3. 1 花粉管通道法简介

1. 3 花粉管通道法

花粉管通道法是利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道, 将含目的基因的DNA放到授粉后不久经切割的花柱上, 植物授粉后,花粉在雌蕊柱头上萌发形成花粉管通道，DNA沿着花粉管到达胚珠,并进一步整合到胚珠的基因组中,转化受精卵或其前后的细胞(卵、早期胚细胞) 当携带外源基因的受精卵发育成植株时，而自然发育成种子,观察其后代的变异,筛选出转基因植物。大豆转基因的研究进展 王利云 09243406 盐城师范学院 盐城 2214000

1. 3. 2 花粉管通道法优缺点

花粉管通道法简单易行,已被许多育种工作者所采用,并培育出一批抗病、抗虫及其他优良性状的农作物新品种或新品系。它的优点是: 大豆遗传转化技术研究进展 杨向东，隋 丽，李启云，杨 静，邢国杰，郭东全，董英山第 31 卷 第 2 期2012 年 4 月大 豆 科 学SOYBEAN SCIENCEVol． 31 No． 2Apr． 2012 304页

(1) 利用整体植株的卵细胞、合子或早期胚细胞转化DNA ,无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程。

(2) 方法简捷,可在大田、盆栽或温室中进行。

(3) 单胚珠和多胚珠的单、双子叶植物均可以应用。

(4) 育种时间短。在自花授粉的基础上只有部分外源DNA 片段进入受体基因组,避免了供体基因与受体基因组全面重组。比较稳定。

(5) 可任选植物品种进行外源DNA 导入,达到目的性状基因的转移。而且可以保留受体的优良性状,无需考虑体细胞变异的问题。

(6) 该技术也适应于重组DNA分子的导入。

缺点是其转化频率很低,重复性也不太高。

图

大豆遗传转化技术在转基因大豆研究中的应用

王振华1 杨德光1 张辉2 胡正2生物技术通报

BIOTECHNOLOGY BULLETIN2010年第10期62

3 大豆遗传转化的主要亟待解决的问题

(1) 转基因大豆植株常常出现嵌合体,转基因不传递到其后代,尤其绝大多数转基因大豆植株是不育的;

(2) 需要进一步促进外源基因的稳定整合及其表达的正调控:

(3) 目前转入大豆具有实用价值的农艺性状的基因非常少。

所转化的外源基因多为单个基因,今后转入双价抗虫(或抗病)基因是大豆转基因的一个方向。

转基因大豆是世界上最早引入商业化种植的转基因农作物之一，也是迄今为止播种面积最大，商业化程度最高的转基因农作物。仅2011 年，全球转基因大豆种植面积就达到 7 540 万 hm2，占大豆总种植面积的 77% 以上，约占全球转基因作物种植总面积的 50%［3］。［3］ James C． Global status of commercialized biotech/GM crops: 2010

［C］． The International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications Brief No． 42． ISAAA: Ithaca，NY． 2011．

转基因技术在大豆领域的应用与推广是20世纪世界农业科技的一项重要成就，它对提高大豆产量、增加农民收入、保护生物多样性、减轻环境压力、减少贫困、增进农业的可持续发展都起到了举足轻重的作用。

尽管目前关于转基因大豆及其食品在各个不同的国度，由于政治体制、社会构成、文化传统、经济利益及消费者态度不同而产生了激烈的争议，一定程度上影响了转基因技术的快速发展，但目前转基因大豆技术依然取得了很大进步并仍将在未来为解决全球食物、饲料、纤维和燃料安全做出更大的贡献。