九种载体的多克隆位点及质粒图谱

九种载体的多克隆位点及质粒图谱

（pLLP-OmpA、pLLP-STII、pMBP-P、pMBP-C、pTrc-CKS、pET-GST、pET-Trx、pET-His、pET-DsbA）

这九种载体的多克隆位点均为 （TAA） CAT CAT BamHI EcoRI NheI His His His His His His HindIII

我们建议您扩增基因5 端选BamHI或BglII，3端选NheI或XbaI或SpeI，同时3端不要带终止密码子，注意与GGA TCC（Gly Ser）表达框架正确，载体用NheI—BamHI双酶切。BamHI和BglII为同裂酶，NheI、XbaI和SpeI为同裂酶。

如您目的基因无法满足上述要求，如同时含有BamHI和BglII，5端可选择EcoRI，但须注意与表达框架GAA TTC（Glu Phe）对齐。如您目的基因同时含有XbaI、NheI和SpeI，3端可选择EcoRI。

如果您的目的基因已带有终止密码子，同样可以进行克隆表达，只是注意有些表达载体是在C端带6个His。

PCR引物设计时BamHI和EcoRI位点的5端保护碱基有2至3个GC即可，而XbaI、NheI和SpeI位点5端保护碱基须在5个左右才容易被酶切割。

（一）pLLp-OmpA

Size: 7.5Kb

多克隆位点：

Plpp lac operator RBS

TG AAA AAG ACA GCT ATC GCG

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala OmpA signal

Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala BamHI

EcoRI NheI 6His-tag HindIII

BamHI EcoRI NheI 6His- stop HindIII

基因克隆表达功能区序列如下，经DNA双向测序验证

ctcactttatctaagatgaatccgatggaagcatcctgttttctctcaatttttttatctaaaacccagcgttcgatgcttctttgagcgaacgatcaaaaataagtgccttcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagctagagaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggattcactggaactctagataacgaggcgcaaaaaatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggcaggtttcgctaccgtcgctcaggctggatccgcagaattcagcgctagccaccatcatcatcatcattaagcttagatccggctgagcaacgacgtgaacgcaatgcgttccgacgttcaggctgctaaagatgacgcagctcgtgctaaccagcgtctggacaacatggctactaaataccgcaagtaatagtacctgtgaagtgaaaaatggcgcacattgtgcgacattttttttgtctgccgtttaccgctactgcgtcacgcgtaacatattcccttgctctggttcaccattctgcgctgactctactgaaggcgcattgctggctgcgggagttgctccactgctcaccgaaaccggataccctgcccgacgatacaacgctttatcgacta 载体其它部分序列见Genebank Locus ASAK3121 (plasmid pIN-III-ompA1)

（二）pLLp-STII

Size: 7.5kb

多克隆住点：

lac operator RBS

TACAT ATG AAA AAG AAC ATC GCA TTC CTC

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu

STII signal

Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala BammHI NheI 6His-tag HindIII

基因克隆表达功能区序列如下，经DNA双向测序验证

ctcactttatctaagatgaatccgatggaagcatcctgttttctctcaatttttttatctaaaacccagcgttcgatgcttctttgagcgaacgatcaaaaataagtgccttcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagctagagaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggattcactggaactctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgaaaaagaacatcgcattcctcctggcatctatgtttgttttctctatcgctaccaacgcttacgctggatccgcagaattcagcgctagccaccatcatcatcatcattaagcttagatccggctgagcaacgacgtgaacgcaatgcgttccgacgttcaggctgctaaagatgacgcagctcgtgctaaccagcgtctggacaacatggctactaaataccgcaagtaatagtacctgtgaagtgaaaaatggcgcacattgtgcgacattttttttgtctgccgtttaccgctactgcgtcacgcgtaacatattcccttgctctggttcaccattctgcgctgactctactgaaggcgcattgctggctgcgggagttgctccactgctcaccgaaaccggataccctgcccgacgatacaacgctttatcgacta

载体其它部分序列见Genebank Locus ASAK3121 (plasmid pIN-III-ompA1) STII signal peptide见Genebank Locus HSTI_ECOLI (p22542)

(三)pMBP-p

Vector size: 6.7kb

Thrombin cut site

Asn Tyr Pro Arg BamHI EcoRI

NheI 6His-tag HindIII

BamHI EcoRI NheI 6His- stop HindIII

基因克隆表达功能区序列如下，经DNA双向测序验证

Gccaccatggaaaacgcccagaaaggtgaaatcatgccgaacatcccgcagatgtccgctttctggtatgccgtgcgtactgcggtgatcaacgccgccagcggtcgtcagactgtcgatgaagccctgaaagacgcgcagactaattcgagctcgaacaacaacaacaataacaataacaac HindIII

载体其它部分序列见pMal-p2

Maltose binding protein(E.coli)编码氨基酸序列见Genebank

MBP MW=42KD

(四)pMBP-c

Vector size: 6.6kb

Thrombin cut site

Asn Tyr Pro Arg BamHI EcoRI

NheI 6His-tag HindIII

BamHI EcoRI NheI 6His- stop HindIII

基因克隆表达功能区序列如下，经DNA双向测序验证

Gccaccatggaaaacgcccagaaaggtgaaatcatgccgaacatcccgcagatgtccgctttctggtatgccgtgcgtactgcggtgatcaacgccgccagcggtcgtcagactgtcgatgaagccctgaaagacgcgcagactaattcgagctcgaacaacaacaacaataacaataacaac HindIII

载体其它部分序列见pMal-c2

Maltose binding protein(E.coli)编码氨基酸序列见Genebank

MBP MW=42KD

（五）pET-GST

vector size: 3.7kb

多克隆位点：

P3C cut site

PT7 — —CTC GAA GTT CTG TTT CAG Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro BamHI EcoRI NheI 6His-tag HindII

基因克隆表达功能区序列如下，经DNA双向测序验证

XbaI tcc cct ata cta ggt tat tgg aaa att aag ggc ctt gtg caa ccc act cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat gaa gag cat ttg tat gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa aag ttt gaa ttg ggt ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat ggt gat gtt aaa tta aca cag tct atg gcc atc ata cgt tat ata gct gac aag cac aac atg ttg ggt ggt tgt cca aaa gag cgt gca gag att tca atg ctt gaa gga gcg gtt ttg gat att aga tac ggt gtt tcg aga att gca tat agt aaa gac ttt gaa act ctc aaa gtt gat ttt ctt agc aag cta cct gaa atg ctg aaa atg ttc gaa gat cgt tta tgt cat aaa aca tat tta aat ggt gat cat gta acc cat cct gac ttc atg ttg tat gac gct ctt gat gtt gtt tta tac atg gac cca atg tgc ctg gat gcg ttc cca aaa tta gtt tgt ttt aaa aaa cgt att gaa gct atc cca caa att gat aag tac ttg aaa tcc agc aag tat ata gca tgg cct ttg cag ggc tgg caa gcc acg ttt ggt ggt ggc gac cat cct cca aaa tcg gac agc atg cca gac tct ctc HindIII

载体其它部分序列见pUC18(不含pUC18多克隆位点)

Glutathione S-transferase编码氨基酸序列如下（含多克隆位点）：

MSPILGYMKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDSMPDS248 AMINO ACIDS

MW 28.7KD

（六）pET-Trx

vector size: 3.3kb

多克隆位点：

P3C cut site — —CTC GAA GTT CTG TTT CAG Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro BamHI EcoRI NheI stop HindIII

基因克隆表达功能区序列如下，经DNA双向测序验证

XbaI

tctgataaaattattcatctgactgatgattcttttgatactgatgtacttaaggcagatggtgcaatcctggttgatttctgggcacactggtgcggtccgtgcaaaatgatcgctccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcacaacccgggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggctggctctagcat HindIII 载体其它部分序列见pUC18(不含pUC18多克隆位点)

Thioredoxinmut(His-patch) (E.coli)编码氨基酸序列如下（含多克隆位点）：

MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAHWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDHNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSSMPDSLEVLFQGPAGSAEFSAS

133 AMINO ACIDS

MW 14KD

3 个His形成立体His-patch

（七）pET-His

vector size: 2.9kb

多克隆位点：

thrombin cut site

— CTG GTG CCG CGC Leu Val Pro Arg BamHI EcoRI

NheI HindIII

BamHI EcoRI NheI stop HindIII

基因克隆表达功能区序列如下，经DNA双向测序验证

XbaI

HindIII

载体其它部分序列见pUC18 (不含pUC18多克隆位点)

(八)PTRC-CKS

vector size: 5.2kb

多克隆位点：

P3C cut site

PTrc — CTC GAA GTT CTG TTT CAG Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro BamHI EcoRI NheI 6His-tag HindIII

BamHI EcoRI NheI 6His-stop HindIII

mut

基因克隆表达功能区序列如下，经DNA双向测序验证

XbaI

agttttgtggtcattattcccgcgcgctacgcgtccacgcgtctgcccggtaaaccattggttgatattaacggcaaacccatgattgttcatgttcttgaacgcgcgcgtgaatcaggtgccgagcgcatcatcgtggcaaccgatcatgaggatgttgcccgcgccgttgaagccgctggcggtgaagtatgtatgacgcgcgccgatcatcagtcaggaacagaacgtctggcggaagttgtcgaaaaatgcgcattcagcgacgacacggtgatcgttaatgtgcagggtgatgaaccgatgatccctgcgacaatcatccgtcaggttgctgataacctcgctcagcgtcaggtgggtatggcgactctggcggtgccaatccacaatgcggaagaagcgtttaacccgaatgcggtgaaagtggttctcgacgctgaagggtatgcactgtacttctctcgcgccaccattccttgggatcgtgatcgttttgcagaaggccttgaaaccgttggcgataacttcctgcgtcatcttggtatttatggctaccgtgcaggctttatccgtcgttacgtcaactggcagccaagtccgttagaacacatcgaaacgttagagcagcttcgtgttctgtggtacggcgaaaaaatccatgttgctgttgctcaggaagttcctggcacaggtgtggatacccctgagHindIII

载体其它部分序列见pTrcHisB(不含pTrcHisB多克隆位点)

CKSmut(E.coli CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonate cytidylyltransferase or CMP-KDO synthetase)编码氨基酸序列如下(含多克隆位点)：

MSFVVIIPARYASTRLPGKPLVDINGKPMIVHVLERARESGAERIIVATDHEDVARAVEAAGGEVCMTRADHQSGTERLAEVVEKCAFSDDTVIVNVQGDEPMIPATIIRQVADNLAQRQVGMATLAVPIHNAEEAFNPNAVKVVLDAEGYALYFSRATIPWDRDRFAEGLETVGDNFLRHLGIYGYRAGFIRRYVNWQPSPLEHIETLEQLRVLWYGEKIHVAVAQEVPGTGVDTPEDGSMPDSPAGSAEFSASHHHHHH

268 Amino Acids Molecular Weight 29KD

（九）PET-DsbA

vector size: 3.6kb

thrombin cut site

— ATG TAT CCG CGT Met Tyr Pro Arg BamHI

 EcoRI NheI stop HindIII

基因克隆表达功能区序列如下，经DNA双向测序验证）

XbaI

gtaaacagtacactaccctggaaaaaccggtagctggcgcgccgcaagtgctggagtttttctcyyycttcagcccgcattcctatcagtttgaagaagttctgcatatttctgataatgtgaagaaaaaactgccggaaggcgtgaagatgactaaataccacgtcaacttcatgggtggtgacctgggcaaagatctgactcaggcatgggctgtggcgatggcgctgggcgtggaagacaaagtgactgttccgctgtttgaaggcgtacagaaaacccagaccattcgttctgcttctgatatccgcgatgtatttatcaacgcaggtattaaaggtgaagagtacgacgcggcgtggaacagcttcgtggtgaaatctctggtcgctcagcaggaaaaagctgcagctgacgtgcaattgcgtggcgttccggcgatgtttgttaacggtaaatatcagctgaatccgcagggtatggataccagcaatatggatgtttttgttcagcagtatgctgatacagtgaaatatctgtccgagaaaaaaggtgatgaagat HindIII

载体其它部分序列见pUC18(不含pUC18多克隆位点)

DsbAmut(E.coli)编码氨基酸序列如下(含多克隆位点)：

MGSSHHHHHHSSGAQYEDGKQYTTLEKPVAGAPQV;EFFSFFSPHSYQFEEVLHISDNVKKKLPEGVKMTKYHVNFMGGDLGKDLTQAWAVAMALGVEDKVTVPLFEGVQKTQTI RSAS DIRDVFINAGIKGEEYDAAWNSFVVKSLVAQQEKAAADVQLRGVPAMFVNGKYQLNPQGMDTSNMDVFVQQYADTVKYLSEKKGDEDEDEDS223 Amino Acids

Molecular Weight 24.7KD