素对巨噬细胞吞噬和分泌功能的影响

・６５０・

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・实验研究・

肾上腺素对巨噬细胞吞噬和分泌功能的

影响

周建云

蒋建新严军杨策刘庆程英王海燕周琳琳顾玮

目的

曾灵

【摘要】

观察肾上腺素对巨噬细胞吞噬和分泌功能的影响。方法收集大鼠腹腔巨噬

细胞，采用不同浓度肾上腺素（Ｅ）（２—１００斗ｇ／Ｌ）刺激１

ｈ或１０彬Ｌ肾上腺素刺激不时间，检测细

胞趋化、黏附、吞噬功能和培养上清ＴＮＦ－仅的浓度。结果低浓度肾上腺紊处理时，巨噬细胞趋化、

黏附、吞噬功能均明显增强，细胞分泌ＴＮＦ－ｄ明显增多，其中以１０∥Ｌ肾上腺素处理时细胞功能增

强最明显。但是随着肾上腺素浓度进一步增加，巨噬细胞功能未见进一步增强。时效实验结果显示，不同时间处理（Ｏ．５～５．０）ｈ可不同程度地增强巨噬细胞趋化、黏附、吞噬和分泌’ＩＮＦ．仪的功能，其中以处理１ｈ作用最明显。结论适度肾上腺素刺激可明显增强巨噬细胞免疫功能。

【关键词】

ＴｌＩｅ

肾上腺素；

ｏｎ

巨噬细胞；免疫ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ

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【Ｋｅｙｗｏｒ‘ｌｓ】

Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ；

交感一肾上腺髓质系统（ｓＡＭ）是神经内分泌的一个重要反应轴，肾上腺素是其主要的内分泌激素之

一¨Ｊ，巨噬细胞是创伤早期最为重要的免疫效应细

材料与方法

胞旧ｏ。我们通过体外实验探讨不同浓度肾上腺素对

巨噬细胞免疫功能的影响，观察创伤早期神经内分泌

１．材料：成年雄性ｓＤ大鼠（２２０—２５０）ｇ，购自大坪医院野战外科研究所动物中心，实验前禁食４ｈ，自

由饮水。ＲＰＭＩ１６４０培养基购自美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，胎牛血清（ＦＢｓ）购自民海生物，肾上腺素（Ｅ）购自美国ｓｉｇｒｎａ，ＴＮＦ—ｄ检测用ＥＬＩＳＡ试剂盒购自美国Ｒ＆Ｄ

ｔｅｍｓ，ｓｙｓｍｅｘ

ｓｙｓ—

反应对免疫功能的影响，为探讨预防创伤感染的发生

提供实验依据。

Ｆ一８２０细胞计数仪为日本Ｓｙｓｍｅｘ公司，趋

化小室购自美国ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ，５斗ｍ趋化滤膜为美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司。

基金项目：国家重点基础研究发展规划项目（“９７３”项目）（２００５ｃＢ５２２６０２）；全军“十一五”科技攻关项目（０６Ｇ０８０）

２．腹腔巨噬细胞的分离、培养：大鼠腹腔巨噬细胞（ＰＭ‘ｐ）的分离、培养参照Ｃｈｏｕ等【３Ｊ，略有改进。每批取４只雄性ＳＤ大鼠，麻醉后消毒腹部皮肤后向腹腔注射４０ｍｌ预冷的ＰＢＳ，按摩ｌ～２ｍｉｎ后，打开腹腔回

作者单位：４０００４２重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所第

四研究室创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室

通讯作者：蒋建新

万方数据

生堡塞验处型盘查！鲤！生ｉ旦筮堑鲞筮！翅ｇ婪！』曼！Ｐ！！！ｇ：坚型！塑！：Ｙ堂：箜：№：！

・６５ｌ・

抽灌注液（可回抽３５ｍｌ左右），以３００ｇ离心力４℃离心１０ｍｉｎ，细胞沉淀用ＲＰＭＩ１６４０培养基（含１０％

ＦＢｓ，２０ｍｍｏＬ／Ｌ谷氨酰胺，１００ｕ／ｍｌ青霉素和

１００ｕ／ｍｌ链霉素）重悬，混合收集的细胞后按照２×

１０６

ｃｅｌｌｓ／孔的密度接种至２４孔板，５％Ｃ０：，饱和湿

度，３７℃培养箱培养２ｈ后，用预温的Ｄ—Ｈａｎｋ’ｓ液轻

轻洗涤细胞２次以纯化巨噬细胞。经驯曲ｔ’ｓ染色来

鉴定巨噬细胞，台盼蓝染色显示细胞活率超过９５％。

３．巨噬细胞趋化功能的检测：实验方法参照文献［４］，用结合缓冲液（ＢＭ）将所收集的腹腔细胞调整密

度至５×１０６何ｍ１。向趋化小室下板每孔加入２８斗ｌ

ＦＭＬＰ（１×１０～ｍｏＬ／Ｌ）作为巨噬细胞的趋化因子，以结合缓冲液为阴性对照，趋化小室上下板间隔以５仙ｍ孑Ｌ径的趋化滤膜，上室每孔加入５０斗ｌ含有不同终质量浓度肾上腺素（２、ｌＯ、５０、１００灿ｇ／Ｌ）的细胞悬液，以无肾上腺素处理细胞为对照（每批实验各浓度设３个复孔，共重复４次）。趋化小室置５％Ｃ０：，饱和湿度，ｈ后，取出滤膜，经过刮膜、干燥、固定、４．巨噬细胞黏附功能的检测：实验方法参照文献［５］。用ＲＰＭＩ１６４０完全培养基将所收集的腹腔细胞调整密度至１．５×１０６爪／ｍｌ，按５００汕Ｌ／管加入１．５

ｍｌ

ＥＰ管内，然后分别加人２０恤ｌ肾上腺素，并达到对应的照（各浓度设３个重复管），ＥＰ管置３７℃水浴摇床分ｍｉｎ，各时间点分别取１００斗ｌ细

附指数（ＡＩ）表示。

５．巨噬细胞吞噬功能的检测：实验方法参照文献［６］，向过夜培养的巨噬细胞中加入不同终质量浓度的肾上腺素（２、１０、５０和１００¨∥Ｌ），以培养基作为对照（每批次各浓度设３个复孑Ｌ，共重复３次）。５％ｃ０：，饱和湿度，３７℃培养箱内处理相应时间后，收集ｍｌ

ＥＰ管，一８０℃保存；细胞用预温的

Ｄ－Ｈａｎｋ’ｓ液轻轻洗涤细胞２次后，每孔准确加入

ｍｌＲＰＭＩ

１６４０完全培养基以及５０斗ｌ密度为２×

１０８爪／ｍｌ的表达有红色荧光蛋白的大肠杆菌，吞噬

ｍｉｎ，洗涤后经４％多聚甲醛固定，激光共聚焦显微

ｎｍ，检测波长５６８ｎｍ）。细胞内ｉｎｄｅｘ）和吞噬ｒａｔｅ）表示‘４，６１。

６．培养上清ＴＮＦ一旺浓度的检测：按照ＥＬＩｓＡ试剂万方数据

７．统计学方法：所有数据都以均数±标准差（元±

ｓ）表示。使用ｓＰＳＳ１０．ｏ统计软件分析，其中。肾上腺素对细胞黏附、趋化、吞噬功能以及ＴＮＦ．ｄ分泌影响的量效关系结果采用单因素方差分析（ｏｎｅｗａｙ

ＡＮ０一

ＶＡ），对吞噬功能和ＴＮＦ—ｏ【分泌影响的时效关系结果

采用独立样本的ｔ检验。

结

果

１．大鼠腹腔巨噬细胞培养及鉴定：贴壁纯化后大

鼠腹腔巨噬细胞形态不规则，多数细胞有伪足伸出；经ｗｒｉｇｈｔ’ｓ染色和ＨＥ染色后，细胞伪足更清晰，视野中

９０％以上为不规则形的巨噬细胞。

２．肾上腺素对大鼠腹腔巨噬细胞趋化功能的影响：随着肾上腺素刺激浓度的增加（２—１００¨∥Ｌ），巨噬细胞趋化指数先升高后降低，在１０斗∥Ｌ肾上腺素刺激时达到峰值；２和１０“∥Ｌ肾上腺素处理后细胞趋化指数显著高于对照（Ｐ＜Ｏ．０５），而５０及１００斗∥Ｌ肾上腺素处理组则与对照组差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。

３．肾上腺素对大鼠腹腔巨噬细胞黏附功能的影响：各浓度’肾上腺素处理组巨噬细胞黏附指数均随黏附时间的延长而增加；在不同时间点，不同浓度肾上腺

素处理后细胞黏附指数不同程度增加，在黏附１０

ｍｉｎ

时，（２一１００）仙ｇ／Ｌ肾上腺素均可显著增强细胞的黏附功能（Ｐ＜Ｏ．０５），其中ｌＯ汕ｇ／Ｌ肾上腺素处理后细胞

黏附指数达到峰值；黏附３０ｍｉｎ时，仅２斗ｇ／Ｌ和

ｌｏ“ｇ／Ｌ肾上腺素处理组细胞黏附指数显著高于对照；而在黏附６０ｍｉｎ时，各处理组间差异无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５，表１）。

表１

肾上腺素对巨噬细胞黏附功能的影响（盂±ｓ）

注：与对照组比较，“Ｐ＜０．０１，“Ｊｐ＜０．０５

４．肾上腺素对大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响：不同浓度肾上腺素处理ｌｈ后巨噬细胞吞噬指数和吞噬百分数均不同程度的增加，其中１０斗∥Ｌ肾上腺

素处理后细胞吞噬指数和吞噬百分数均达到峰值，显

著高于对照组（Ｐ＜ｏ．０１）。使用ｌＯ肛ｇ／Ｌ肾上腺素处理巨噬细胞不同时间（０．５～５ｈ），细胞的吞噬指数和吞噬百分数均增加，但是在处理１ｈ时增加最明显（Ｐ＜０．０１），随后增加趋势逐渐减弱（表２）。

３７℃培养箱２染色后，显微镜下计数，趋化结果以趋化指数（ＣＩ）表示。

终质量浓度（２、１０、５０、１００斗ｇ／Ｌ），以培养基为阴性对别振荡培养１０、３０、６０胞悬液，用细胞计数仪检测其细胞密度，黏附功能以黏

培养上清至１．５

Ｏ．５３０

镜观察（激发波长４８８有红色荧光信号的巨噬细胞视为吞噬了细菌的细胞，细胞的吞噬功能以吞噬指数（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ率（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ盒操作步骤，每个样本取１００斗ｌ，检测ＴＮＦ—ｄ的浓度。

・６５２・

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表２１０恤ｇ／Ｌ肾上腺素处理对巨噬细胞吞噬功能

影响的时效关系（面±ｓ）

处理时间查堕塑塑

查堕亘坌塑

（ｈ）

对照组

Ｅ

对照组

Ｅ

注：与对照组比较，‘ＪＰ＜Ｏ．Ｏｌ，“Ｐ＜Ｏ．０５

５．肾上腺素对大鼠腹腔巨噬细胞分泌ＴＮＦ一仅的

影响：各浓度（２～１００）斗∥Ｌ肾上腺素处理巨噬细胞１

ｈ后，培养上清ＴＮＦ．仪水平均升高，其中１０斗ｇ／Ｌ肾上

腺素处理后ＴＮＦ．ｄ浓度升高趋势最强。在时效作用

关系方面，使用１０斗ｇ／Ｌ肾上腺素分别刺激巨噬细胞

Ｏ．５—５

ｈ后，细胞培养上清ＴＮＦ一仅浓度均升高，其中

以处理１ｈ增加最明显。

讨

论

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，在天然免疫和

特异性免疫应答中发挥重要的作用。趋化、黏附、吞噬和分泌细胞因子是巨噬细胞发挥天然免疫功能的几个

关键环节，同时也是产生特异性免疫应答的基础¨。。巨噬细胞通过趋化作用向病灶迁移和聚集，保证对异物或病原达到充分的清除【４’８Ｊ，而对病原菌的黏附则是其发挥免疫清除功能的第一步哺１，最终通过吞噬作

用达到清除异物并获取免疫记忆的目的。巨噬细胞吞噬异物后被激活，分泌多种细胞因子以进一步维持和调控机体的免疫功能，彻底清除异物和病原菌，其中ＴＮＦ．仪是巨噬细胞分泌的一种重要细胞因子。

本实验结果显示，ｌＯ“ｇ／Ｌ肾上腺素显著增强巨噬细胞趋化功能，提示此浓度肾上腺素有助于巨噬细胞快速到达病灶，为发挥免疫功能奠定基础，其他研究也发现，一定浓度的儿茶酚胺类激素可促进人外周血

单核细胞及其分化的巨噬细胞趋化功能一Ｊ。巨噬细

胞对光滑塑料表面的黏附类似于它在动物体内的黏附过程，１０斗∥Ｌ肾上腺素处理后巨噬细胞黏附功能增强最显著，而随着细胞贴壁时间进一步增加时，各处理组

之间细胞黏附功能差异减小，这与Ｄｅ

ｌａ

Ｆｕｅｎｔｅ等¨１

的研究结果一致；在贴壁６０ｍｉｎ时，各处理组之间无显著差异，此时各处理组细胞中巨噬细胞都已大部分贴壁是其主要原因ｕ０ｌ。巨噬细胞黏附功能增强提示细胞免疫功能被激活。巨噬细胞吞噬能力由吞噬指数和吞噬率来反映旧Ｊ，１０恤∥Ｌ肾上腺素同时增强巨噬细胞的吞噬指数和吞噬率，这种促进作用在０．５～５

ｈ

处理范围内又以ｌｈ最显著，Ｒｏｙ等Ｈｕ也证实一定剂

万方数据

量的肾上腺素可促进脾脏巨噬细胞的吞噬功能，吞噬

指数和吞噬率一致性的变化充分说明１０汕ｇ／Ｌ的肾上

腺素可增强巨噬细胞的吞噬功能。ｌｏ“ｇ／Ｌ肾上腺素

刺激后大鼠腹腔巨噬细胞培养上清ＴＮＦ—ｄ浓度高于其余各处理组，在ｏ．５—５ｈ刺激范围内以１ｈ增加趋

势最显著，其他研究结果显示，肾上腺素可促进人和大鼠ＩＬ＿６的分泌¨引，这说明一定浓度肾上腺素可促进巨

噬细胞的分泌功能。

在２一１００斗ｇ／Ｌ作用浓度范围内，１０斗ｇ／Ｌ肾上腺

素可同时增强巨噬细胞黏附、趋化、吞噬和分泌功能，这种一致性的变化有力地说明了该浓度的肾上腺素可

显著增强巨噬细胞的免疫功能。总之，本实验通过体外模型检测肾上腺素对大鼠腹腔巨噬细胞趋化、黏附、

吞噬和分泌ＴＮＦ—ｄ功能的影响及其量效和时效关系，说明无免疫刺激条件下适当浓度肾上腺素急性刺激可

显著增强巨噬细胞免疫功能，初步反映创伤早期适度

的创伤应激可通过交感一肾上腺髓质轴及分泌肾上腺

素提高机体的免疫力。

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肾上腺素对巨噬细胞吞噬和分泌功能的影响

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：引用次数：

周建云， 蒋建新， 严军， 杨策， 刘庆， 程英， 王海燕， 周琳琳， 顾玮， 曾灵第三军医大学大坪医院野战外科研究所第四研究室创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆,400042

中华实验外科杂志

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9.Straub RH.Mayer M.Kreutz M Neumtransmittem of the sympathetic nerve terminal are powerfulchemoattractants for monocytes 2000

10.Asfora KK.Santos Mdo C.Montes MA Evaluation of biOCOmpatibility of sodium perborate and

30%hydrogen peroxide using the analysis of the adherence capacity and morphology of maerophages 200511.Roy B.Rai U Dual mode of catecholamine action on splenic macrophage phagocytosis in walllizard,Hemidactylus flaviviridis 2004

12.Steensberg A.Toft AD.Schjerling P Plasma interleukin-6 during strenuous exercise:role ofepinephrine 2001

相似文献(10条)

1.学位论文 张恺芳 肾上腺素对THP-1源性巨噬细胞脂质转运相关基因表达的影响 2005

目的研究肾上腺素对THP-1源性巨噬细胞脂质转运相关基因表达的影响并初步探讨其作用机制。

　　方法不同浓度肾上腺素(1pmol/L～1μmol/L)处理THP-1源性巨噬细胞24小时，运用逆转录多聚酶链反应方法检测其TGF-β1、CD36、ABCA1、SR-AI、Caveolin-1mRNA表达。然后分别用α1受体拮抗剂prazosin(100pmol/L～1μmol/L)、α2受体拮抗剂yohimbine(1nmol/L～10μmol/L)、β1受体拮抗剂metoprolol(10nmol/L～100μmol/L)和β2受体拮抗剂butoxamine(2.5nmol/L～25μmol/L)预处理细胞1小时，再加入终浓度为1μmol/L肾上腺素继续孵育24小时，检测受试基因的表达。

　　结果1pmol/L～10nmol/L的肾上腺素对受试基因mRNA的表达与相应对照组比较其差异无统计学意义(p＞0.05)。而100nmol/L及1μmol/L的肾上腺素作

用后，TGF-β1mRNA水平分别下降17.2％和14.7％，SR-AImRNA水平分别升高13.5％和11.7％，ABCA1mRNA水平分别下降9.5％和10.4％，与各自对照组比较其差异有统计学意义(p＜0.05)。但100nmol/L及1μmol/L的肾上腺素对CD36和Caveolin-1mRNA的表达无明显影响，与各自对照组比较其差异无统计学意义(p＞0.05)。终浓度为1μmol/L肾上腺素分别与四种不同浓度的肾上腺素受体拮抗剂prazosin、yohimbine、metoprolol和butoxamine联合作用时，随着prazosin、metoprolol和butoxamine浓度加大，各组TGF-β1和ABCA1mRNA的表达升高而SR-AImRNA的表达随浓度升高而呈下降趋势，且

butoxamine对肾上腺素的拮抗作用在2.5μmol/L达到平台期。但是肾上腺素与不同浓度的yohimbine联合作用组其TGF-β1、SR-AI、ABCA1mRNA的表达与1μmol/L肾上腺素组比较其差异无显著性。　　结论

　　1.肾上腺素上调THP-1源性巨噬细胞SR-AImRNA水平，下调TGF-β1和ABCA1mRNA水平，不影响CD36和Caveolin-1mRNA表达。　　2.肾上腺素可能通过α1、β1和β2肾上腺素能受体介导从而影响THP-1源性巨噬细胞SR-AI、TGF-β1和ABCA1mRNA的表达。

2.期刊论文 陈浩.龙石银.张彩平.郭小芳.乔新惠.田英.CHEN Hao.LONG Shi-yin.ZHANG Cai-pin.GUO Xiao-fang.QIAO Xin-hui.TIAN Yin 肾上腺素对THP-1巨噬细胞TGF-β1、SR-A1和CD36表达的影响 -现代生物医学进展2007,7(11)

目的:探讨肾上腺素对THP-1巨噬细胞TGF-β1、SR-A1和CD36表达的影响.方法:不同浓度肾上腺素处理THP-1巨噬细胞24 h,运用逆转录多聚酶链反应检测其TGF-β1、SR-A1和CD36的mRNA表达,酶联免疫吸附试验检测TGF-β1蛋白的表达,Western-blotting检测SR-A1蛋白的表达.结果:100mol/L及

1μmol/L的肾上腺素作用THP-1巨噬细胞,引起TGF-β1 mR-NA和蛋白表达下调(p＜0.05),SR-A1 mRNA和蛋白表达上调(P＜0.05),1pmol/L～1μmol/L的肾上腺素处理后,各组CD36 mRNA水平无显著性变化(p＞0.05).结论:应激浓度的肾上腺素可能通过影响TGF-β1和SR-A1的表达而参与和/或促进As的发生发展.

3.期刊论文 张力.叶笃筠.吴萍.黄艳君.袁萍.万敬员.吴涛.周晓燕.金胜威.ZHANG Li.YE Du-yun.WU Ping.HUANGYan-jun.YUAN Ping.WAN Jing-yuan.WU Tao.ZHOU Xiao-yan.JIN Sheng-wei 肾上腺素对小鼠巨噬细胞中促炎/抗炎介质比值的影响 -中国病理生理杂志2006,22(3)

目的:研究肾上腺素对脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7中促炎介质[肿瘤坏死因子(TNF-α)、一氧化氮(NO)、环加氧酶-2(COX-2)]和抗炎介质[血红素氧化酶-1(HO-1)、白介素10(IL-10)]表达及NF-κB活化的影响.方法:以10 μg/L的LPS刺激体外培养的RAW264.7细胞作为炎症模型,加入不同浓度的肾上腺素(1、5、10、50μmol/L)孵育24 h后,收集培养上清并提取细胞总蛋白,酶联免疫法测定上清中TNF-α、IL-10浓度,Griess法检测上清NO含量(以NO2-/NO3-表示),免疫印迹法检测细胞总蛋白中COX-2、HO-1、IκB-α的含量.结果:10 μg/L的LPS明显诱导TNF-α、NO(NO2-/NO3-)、COX-2、IL-10及HO-1的产生;LPS+肾上腺素组与LPS单独作用组相比促炎介质TNF-α、NO(NO2-/NO3-)、COX-2的表达量显著下降,而抗炎介质IL-10、HO-1的表达却明显增强;肾上腺素与LPS共同作用组中IκB-α的含量与单独LPS作用组相比无明显差异.结论:肾上腺素下调LPS诱导的巨噬细胞中促炎介质的表达同时促进抗炎介质的表达,这种效应并不通过影响NF-κB的活化来实现.

4.学位论文 董勇 肾上腺素对大鼠动脉粥样硬化斑块稳定性的影响及普萘洛尔的干预作用 2008

本研究分为二部分：

第1部分：肾上腺素对大鼠动脉粥样硬化斑块稳定性的影响

目的：研究肾上腺素对大鼠动脉粥样硬化斑块处巨噬细胞浸润及MMP-9表达的影响，探讨精神应激对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响。

方法：25只Wistar大鼠经高脂、高维生素D、免疫损伤处理17周造成动脉粥样硬化模型，然后随机分为对照组和肾上腺素组，每组10只。所有大鼠在继续高脂喂养基础上，对照组皮下注射生理盐水0.5ml/d；肾上腺素组皮下注射肾上腺素0.5mg/kg.d。分组处理一周后处死全部大鼠，取主动脉粥样斑块用免疫组织化学方法检测巨噬细胞（CD68）浸润及MMP-9表达。

结果：肾上腺素组巨噬细胞浸润明显多于对照组（P

目的：研究普萘洛尔对肾上腺素引起的大鼠动脉粥样硬化斑块处巨噬细胞浸润及MMP-9表达的改变的干预作用，探讨β-受体阻滞剂对应激导致的动脉粥样硬化斑块稳定性降低的保护作用。

方法：55只Wistar大鼠经高脂、高维生素D、免疫损伤处理17周造成动脉粥样硬化模型，然后随机分为对照组、肾上腺素组、普萘洛尔小剂量组、普萘洛尔中剂量组、普萘洛尔大剂量组，每组10只。所有大鼠在继续高脂喂养基础上，对照组皮下注射生理盐水0.5ml/d；肾上腺素组予肾上腺素

0.5mg/kg.d皮下注射；普萘洛尔小、中、大剂量组分别予普萘洛尔2.5mg/kg.d、5mg/kg.d、7.5mg/kg.d灌胃，半小时后皮下注射肾上腺素0.5mg/kg.d。分组处理一周后处死全部大鼠，取主动脉粥样斑块用免疫组织化学方法检测巨噬细胞（CD68）浸润及MMP-9表达。

结果：肾上腺素组巨噬细胞浸润及MMP-9的表达明显高于对照组（P

结论：普萘洛尔可拮抗肾上腺素引起的大鼠动脉粥样硬化斑块稳定性降低。

5.期刊论文 张恺芳.郭小芳.田英.ZHANG Kai-fang.GUO Xiao-fang.TIAN Ying 应激性肾上腺素对THP-1源性巨噬细胞TGF-β1与SR-AI mRNA表达的影响 -中国全科医学2006,9(13)

目的探讨心理应激时肾上腺素对THP-1源性巨噬细胞TGF-β1与SR-AI mRNA表达的影响.方法不同浓度肾上腺素(1 pmol/L～1 μmol/L)处理THP-1源性巨噬细胞24 h,运用逆转录多聚酶链反应检测其TGF-β1 与SR-AI mRNA表达.结果 1～10 nmol/L的肾上腺素对受试基因mRNA的表达与相应对照组比较差异无显著性意义(P＞0.05).而100 nmol/L及1 μmol/L的肾上腺素下调TGF-β1 mRNA水平和上调SR-AI mRNA水平,与各自对照组比较差异均有显著性意义(P＜0.05).结论一定浓度的肾上腺素可下调THP-1源性巨噬细胞TGF-β1 mRNA水平,上调其SR-AI mRNA水平.

6.学位论文 周建云 主要应激激素对巨噬细胞功能的影响及其分子机制 2008

全身感染或脓毒症是严重创伤较为常见的并发症，目前对其救治仍缺乏有效手段，提示创伤早期预防感染的发生具有重要意义。应激，即神经内分泌反应，伴随创伤而即刻发生，众多研究显示神经内分泌反应对免疫功能具有重要的调控作用，但其具体分子机制不明。HPA轴和SAM轴是机体主要神经内分泌反应轴，糖皮质激素、肾上腺素和去甲肾上腺素是其主要激素。内质网是细胞蛋白合成与分泌的主要场所，对维持细胞功能至关重要，内质网应激是一种保护性的细胞反应；模式识别受体在感染时识别细菌各成分和介导效应细胞活化方面发挥关键作用。为此，本课题围绕主要应激激素对巨噬细胞功能的影响及其可能分子机制，重点开展以下三个方面的研究：(1)皮质酮、肾上腺素和去甲肾上腺素对巨噬细胞免疫功能的影响；(2)内质网应激在激素对巨噬细胞免疫调控中的作用；(3)主要应激激素对LPS激活巨噬细胞的影响，并初步探讨模式识别受体在此过程中的作用。旨在揭示创伤早期神经内分泌反应对巨噬细胞免疫功能的影响及其分子机制，为创伤感染的早期预防与后期救治提供新思路。

方法：(1)检测巨噬细胞黏附、趋化、吞噬和分泌TNFα功能，以观察其免疫功能的变化情况。(2)RT-PCR法检测内质网应激关键因子GRP78、XBP1基因表达情况；以诱导剂毒胡萝卜素诱导巨噬细胞内质网应激；XBP1-RNAi慢病毒感染以干扰巨噬细胞XBP1基因表达。(3)RT-PCR法检测CD14、SR和TLR4等几种模式识别受体基因表达情况；转染CD14siRNA以干扰巨噬细胞CD14基因表达。

结果：(1)低浓度皮质酮、肾上腺素和去甲肾上腺素可显著增强巨噬细胞黏附、趋化和吞噬功能，促进其分泌TNFα，高浓度对其无影响。(2)免疫增强所对应浓度的皮质酮、肾上腺素和去甲肾上腺素可明显促进巨噬细胞GRP78和XBP1基因的表达；以诱导剂毒胡萝卜素诱导巨噬细胞内质网应激可明显增强其趋化、吞噬和分泌TNFα功能；以XBP1干扰慢病毒转染阻断内质网应激反应后，巨噬细胞吞噬和分泌TNFα功能明显降低。(3)低浓度皮质酮、肾上腺素和去甲肾上腺素预处理促进LPS诱导巨噬细胞吞噬和分泌TNFα，高浓度则出现抑制作用；活化巨噬细胞所对应浓度的皮质酮、肾上腺素和去甲肾上腺素可促进巨噬细胞CD14和SR基因的表达；转染CD14siRNA降低细胞CD14mRNA水平后，巨噬细胞的吞噬和分泌TNFα功能明显受抑。

结论：一定浓度主要应激激素可增强巨噬细胞免疫功能，内质网应激是其重要机制；一定浓度的应激激素可增敏LPS对巨噬细胞的活化，此过程与模

式识别受体表达水平的升高密切相关。提示创伤早期适度的神经内分泌反应可增强机体免疫功能，并增敏继发感染对免疫细胞的活化作用，内质网应激和模式识别受体CD14、SR表达升高分别起到重要作用。

7.期刊论文 张力.叶笃筠.吴萍.万敬员.张代娟.吴涛.周小燕 肾上腺素对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞炎症介质表达的影响 -华中科技大学学报（医学版）2004,33(5)

目的研究肾上腺素对脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7中肿瘤坏死因子(TNF-α)、一氧化氮(NO)、环加氧酶-2(COX-2)等表达的影响.方法以10 ng/ml的LPS刺激体外培养的RAW264.7细胞作为炎症模型,加入不同浓度的肾上腺素(1×10-6,5×10-6,1×10-5,5×10-5 mol/L)孵育24 h后,收集培养上清并提取细胞总蛋白,酶联免疫法测定上清中TNF-α浓度,Griess法检测上清NO含量,免疫印迹法检测细胞总蛋白中COX-2的表达量.结果10

ng/ml的LPS明显诱导TNF-α、NO、COX-2的产生,这一效应可被肾上腺素抑制;而单独加入肾上腺素时,对上述3种炎症介质的表达无明显影响.结论肾上腺素下调LPS诱导的巨噬细胞中炎症因子的表达,可能对炎症的发生发展起到一定的调节作用.

8.外文期刊 Hasko.G.Shanley.TP.Egnaczyk.G.Nemeth.ZH.Salzman.AL.Vizi.ES.Szabo.C Department ofPharmacology, Institute of Experimental Medicine, Hungarian Academy of Sciences, Budapest.

Noradrenaline (NA) and adrenaline (Ad) are modulators of cytokine production. Here we investigated the role of these

neurotransmitters in the regulation of macrophage inflammatory protein (MIP)-1alpha expression. Pretreatment of RAW 264.7 macrophageswith NA or Ad decreased, in a concentration-dependent manner (1 nM-100 microM), MIP-1alpha release induced by bacterial

lipopolysaccharide (LPS 10 ng ml(-1) LPS). The effect of NA was reversed by the selective beta-adrenoceptor antagonist propranolol(10 microM), but not by the alpha-adrenoceptor antagonist phentolamine (10 microM). In the concentration range of 10 nM-10 microM,isoproterenol, a beta-adrenoceptor agonist, but not phenylephrine (a selective alpha1-adrenoceptor agonist) or UK-14304 (a selectivealpha2-adrenoceptor agonist) mimicked the inhibitory effects of catecholamines on MIP-1alpha production. Increases in intracellularcyclic adenosine monophosphate, elicited either by the selective type IV phosphodiesterase inhibitor rolipram (0.1 - 10 microM), orby prostaglandin E2, (10 nM-10 microM) decreased MIP-1alpha release, suggesting that increased cyclic AMP may contribute to thesuppression of MIP-1alpha release by beta-adrenoceptor stimulation. Northern blot analysis demonstrated that NA (100 nM-10 microM),Ad, isoproterenol, as well as rolipram (100 nM-10 microM) decreased LPS-induced MIP-1alpha mRNA accumulation. NA and Ad (1-100microM) also decreased MIP-1alpha production in thioglycollate-elicited murine peritoneal macrophages. Pretreatment of mice witheither isoproterenol (10 mg kg(-1), i.p.) or rolipram (25 mg kg(-1), i.p.) decreased LPS-induced plasma levels of MIP-1alpha, whilepropranolol (10 mg kg(-1), i.p.) augmented the production of this chemokine, confirming the role of a beta-adrenoceptor mediatedendogenous catecholamine action in the regulation of MIP-1alpha production in vivo. Thus, based on our data we conclude thatcatecholamines are important endogenous regulators of MIP-1alpha exp

9.学位论文 龙石银 儿茶酚胺类激素对外周细胞炎性因子表达影响的研究 2006

第一部分

研究背景：动脉粥样硬化(artherosclerosis，As)病程复杂，涉及到内皮损伤，粘附分子表达增强，血小板附着血管壁，单核淋巴细胞粘着渗入到动脉壁，促炎细胞因子出现，LDL的氧化和浸润，单核细胞增生、迁移、活化，巨噬细胞和平滑肌泡沫化等。目前对AS发病机理主要有脂肪浸润、血小板聚集和血栓形成、平滑肌细胞克隆和损伤反应等学说。近来研究发现，As的病理表现具有炎症病理的基本表现形式，随着炎症细胞和炎症介质在动脉粥样硬化斑块中的不断检出，越来越多的研究结果支持As不单纯是内皮损伤后被动的脂质浸润或修复过程，更是一种活跃的炎症性疾病。许多证据表明心理应激是心血管疾病的危险因子，心理社会因素参与一部分心血管疾病如As的起病和进程，心血管疾病与心理社会因素之间的关联日益引起重视，但其生物学机制并不十分清楚。

应激是内环境稳态受到威胁的状态，当机体受到环境、心理、生理性应激原等的刺激时均可引起机体应激反应，激活交感神经系统

(sympatheticnervous system，SNS)和下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)产生相应的生理学变化。在易感者或高危人群中，反复的急性应激或者慢性应激激活SNS、HPA等可引起儿茶酚胺类激素、皮质类固醇等一系列的应激性激素的释放，结果导致心血管反应性增高，改变血流和血压导致内皮损伤和血小板附壁；细胞因子和其它因子诱导功能异常的内皮细胞表达粘附分子，募集单核淋巴细胞粘着进入内膜。反复的急性应激或者慢性应激也可激活单核细胞、肥大细胞等，产生细胞因子和炎性介质等可加重炎症反应。即应激时的皮质类固醇和儿茶酚胺类激素实际上启动了和炎症反应相似的调节机制，如生成细胞因子和急性期反应物质，心理性刺激触发的应激反应涵盖了炎性反应。因此研究应激性心理社会因素所升高的应激类激素启动、参与或／和促进动脉粥样硬化的炎性反应的分子机制具有重要的意义。

在前期研究儿茶酚胺类激素对THP-1细胞泡沫化影响的基础上，采用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)筛选鉴定去甲肾上腺素诱导THP-1细胞表达上调基因，对筛选所获得的能促进炎症应答诱导和维持的CDl37、IL-6进行了初步研究，并进一步观察肾上腺素、去甲肾上腺素以及皮质醇分别作用17HP-1细胞、THP-1源性巨噬细胞、内皮细胞后，炎性因子CDl37、IL-6、高迁移率族蛋白Bl(high-mobility group box-1，HMGBl)基因表达，旨在探讨应激水平的儿茶酚胺类激素在As发生或发展中的作用，将有助于阐明心理应激导致心血管疾病的分子机制。

方法：对THP-1细胞给予应激浓度的去甲肾上腺素刺激(剂量10umol／L，时间1h)后，采用抑制消减杂交筛选差异表达基因，结果在GenBank中进行同源性比较分析。运用逆转录一多聚酶链式反应检测CDl37、IL-6和HMGBl mRNA的表达，酶联免疫吸附试验检测IL-6蛋白的表达。 结果：

1．应激浓度的去甲肾上腺素刺激THP-1细胞后，经斑点杂交筛选获得25个阳性克隆；测序后经BLAST同源性比较，显示有2个序列相同，共获得23个上调表达基因，其中包括19个不同的已知基因和4个新的基因表达序列标签。这些己知基因按功能可分为与炎症反应、细胞凋亡、细胞骨架、胞内能量代谢、凝血、细胞信号转导有关等六组。其中与炎症应答有关的基因包括IL-6和肿瘤坏死因子受体超家族新成员-CDl37等。

2．应激浓度的儿茶酚胺类激素和皮质醇对培养细胞炎性因子的表达有不同程度的影响。(1)去甲肾上腺素作用内皮细胞1小时分别上调CDl37、IL-6mRNA为8.7％和9.7％，作用12小时后其HMGBl mRNA水平上升9.6％；肾上腺素作用6小时分别上调CDl37、IL-6 mRNA为5.9％和4.9％，未观察到对HMGBlmRNA表达的影响。(2)应激浓度的肾上腺素和去甲肾上腺素分别作用THP-1细胞、THP-1源性巨噬细胞后对CDl37和lL-6 mRNA上调的影响基本一致。肾上腺素作用THP-1源性巨噬细胞1小时HMGBl mRNA水平上升40.6％，对THP-1细胞HMGBl mRNA表达无影响；去甲肾上腺素能上调单核／巨噬细胞HMGBl的表达。(3)1mmol／L的皮质醇作用THP-1细胞和THP-1源性巨噬细胞1小时，分别上调CDl37的表达12.8％和14.1％，对IL-6和HMGBl的表达无影响；作用内皮细胞1小时对CDl37、lL-6和HMGBl的表达与对照组比较其差异无统计学意义。(4)ELJSA法检测应激浓度的儿茶酚胺类激素作用内皮细胞、TFHP-l细胞和THP-l源性巨噬细胞后，细胞上清中IL-6蛋白的水平均较对照组升高。 结论：

1．应激浓度的去甲肾上腺素刺激THP-l细胞后能上调CDl37、IL-6、TGF β Rl等基因的表达，从而影响单核细胞的功能。

2．应激浓度的儿茶酚胺类激素和皮质醇能不同程度的上调内皮细胞、THP-l细胞和THP-1源性巨噬细胞CDl37、IL-6和HMGBl基因的表达，提示应激产生的儿茶酚胺类激素和皮质醇参与启动和／或促进外周细胞的炎症反应。 第二部分高脂血症APOE基因多态性与高密度脂蛋白亚类组成的关系

研究背景：高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)是颗粒大小、密度、电泳迁移率、组成及功能极不均一的脂蛋白。其主要功能是参与机体胆固醇的逆向转运。近来研究发现HDL亚类组成与高脂血症、冠心病(CHD)、As发生相关，已有学者提出血清HDL亚类组成及含量变化可作为评价As、CHD危险性及其严重程度的一个指标，但其机理尚未阐明。载脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)是脂蛋白与多种脂蛋白受体结合的配基，在脂蛋白代谢中有重要作用。研究发现APOE基因多态性与冠状动脉疾病和个体血脂水平差异有关。但高脂血症患者APOE基因多态性与HDL亚类颗粒变化之间的关系未见报道。本实验旨在探讨高脂血症患者APOE基因多态性与HDL_亚类组成变化的关系，为As及相关疾病的发生、防治提供理论依据。

方法：应用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性和双向电泳．免疫印迹检测法，分析112例高脂血症患者和73名正常对照者APOE基因型、HDL各亚类组成及相对含量。

结果：高脂血症组和对照组APOE基因型及等位基因频率分布以E3／3和e3最高。高脂血症患者中等位基因e2携带者血清APOE／CⅢ较等位基因e3升高，HDL则下降，其差异有显著性。对照组中等位基因e2携带者血清甘油三酯、．APOE、APOE／CⅢ较等位基因e3和e4携带者升高，等位基因e2携带者

HDL较等位基因e3携带者降低，其差异有显著性。

结论：APOE基因多态性可能与血清HDL部分亚类的含量变化相关。

第三部分高脂血症患者HDL亚类组成与脂蛋白酯酶基因胁HindⅢ多态性的关系

研究背景：各种高密度脂蛋白亚类性状不同但代谢密切相关。大量研究表明HDL直接影响动脉粥样化进程，HDL亚类的分布变化可能与As的发生、发展有关。脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase，LPL)是水解富含甘油三脂脂蛋白的关键酶，其活性与血浆高密度脂蛋白胆固醇水平正相关。大量文献报道LPL基因内含子8HindⅢ酶切位点多态性与血脂水平变化相关。但该位点基因突变是否可能通过影响血脂水平及HDL组成而与高脂血症、As发生发展有关，目前未见报道。因此我们分析高脂血症患者和血脂正常者LPL基因内含子8HindⅢ酶切位点多态性及HDL亚类组成变化，探讨中国人高脂血症患者LPL基因多态性与HDL亚类变化的规律。可能对于阐释LPL基因内含子8HindⅢ多态性位点与HDL亚类组成的相关性和HDL抗As及CHD的机制提供重要的依据。 方法：应用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性和双向电泳．免疫印迹检测法，分析173例高脂血症患者和155名正常对照者脂蛋白酯酶基因内含子8HindⅢ酶切位点多态性、HDL各亚类组成及相对含量。 结果：

1．高脂血症组和正常对照组均以495TT基因型及T等位基因为主。与对照组相比，高脂血症组495TT基因型及T等位基因增加，而495TG和495GG基因型显著降低，P值

2．高脂血症组小颗粒的preβ-HDL、preβ-HDL、HDL、HDL含量较对照组显著升高，而大颗粒的HDL和HDL水平显著降低。

3．高脂血症组495TT基因型TG、aopBl00、TG／HDL-C、preβ-HDL、HDL较495GG基因型增加，而HDL、HDL含量减少(p显著升高，而HDL降低。

结论：中国人高脂血症患者脂蛋白酯酶基因HindⅢ酶切位点多态性与HDL亚类的组成及成熟代谢相关，495TT基因型其血浆HDL颗粒有变小趋势，表明高脂血症患者495TT基因型携带者胆固醇逆向转运减弱。

10.外文期刊 Sigola.LB.Zinyama.RB Adrenaline inhibits macrophage nitric oxide production throughbeta1 and beta2 adrenergic receptors.

This study was conducted to investigate the role of the acute stress hormone adrenaline on macrophage nitric oxide (NO)production. Murine peritoneal macrophages were stimulated in vitro with lipopolysaccharide (LPS) in the absence or presence of

adrenaline. Adrenaline inhibited the LPS-induced nitrite response in a dose-dependent manner. The suppressive effect of adrenaline onNO production was mediated via beta1 and beta2 adrenergic receptors since isoprenaline (a non-selective beta1 and beta2 agonist),dobutamine and salbutamol (selective beta1 and beta2 agonists, respectively) had similar effects on the NO response. In addition, theinhibitory effect of adrenaline on NO was abrogated by both propranolol (a non-specific beta blocker) and atenolol (a specific beta1inhibitor). In contrast to beta receptor activation, the alpha adrenergic agonist phenylephrine had no effect on the LPS NO response,and furthermore, phentolamine (an alpha receptor antagonist) did not ameliorate adrenaline's inhibitory action.

引证文献(1条)

1.杨策.周琳琳.严军.王海燕.周建云.刘庆.程英.崔莉.蒋建新 肾上腺切除大鼠冲击伤后天然免疫功能的变化及其与模式识别受体的关系[期刊论文]-第三军医大学学报 2008(21)

本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zhsywk200805039.aspx

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