牙髓干细胞的研究进展

牙髓干细胞的研究进展

[摘要] 牙髓干细胞是牙髓组织中具有高度增殖、自我更新的能力并可多向分化的一类成体干细胞，在牙髓修复和牙齿再生以及骨组织工程相关研究中发挥重要作用。本文就牙髓干细胞的研究现状作一综述，并讨论其应用前景以及目前存在的问题。

[关键词] 牙髓干细胞；分选；多向分化

干细胞是具有无限或很强的自我更新能力的细胞，能产生至少一种高度成熟的功能细胞。人们对它的青睐主要基于其多向分化的潜能，以及在组织工程学和疾病治疗方面的巨大潜力。根据干细胞来源分为胚胎干细胞和成体干细胞，由于利用胚胎干细胞面临复杂的伦理学问题和实际操作的困难，对成体干细胞的研究就具有更加深远的意义[1]。

1 牙髓干细胞的定义

口腔成体干细胞包括牙周膜干细胞、牙髓于细胞(dental pulp stem cells，DPSCs) 、唾液腺干细胞、根尖牙乳头干细胞等。Gronthos 等[2]根据干细胞具有体外分裂增殖的能力，首次报道从体外培养的成人牙髓组织中获得集落状生长的细胞，该细胞可被诱导分化为成牙本质样细胞并形成牙本质样结构，由此提出了DPSCs 的概念，证实牙髓组织中设想的干细胞群体是存在的。现在普遍认为牙髓组织中具有形成细胞克隆能力和较强增殖能力的未分化问充质细胞即DPSCs 。其依赖于微环境的调节，可增殖分化为各种不同种类的功能细胞。

2 DPSCs的培养及分选

2．1 DPSCs的培养

提供最佳的培养条件是干细胞研究中最大的挑战，尤其是保证干细胞处于未分化状态或者在需要的时候使干细胞向专一的方向分化更是重点。DPSCs 以静息状态存在于特殊的血管微环境，维持其基本的干细胞特征，包括自我更新能力和未分化状态[3]。因此在培养DPSCs 时，要考虑它们的龛位微环境，从而尽可能找到体外培养时维持它们“干性(sternness)”的个性方案。

Gronthos12 基于DPSCs 具有贴壁生长和形成独立的克隆样集落的能力，利用酶消化法通

过70μm 滤膜获得单细胞悬液，在含有20％胎牛血清的α一MEM 培养基中培养。通过相差显微镜观察到了明显的集落形成，细胞呈典型的成纤维细胞样纺锤型。随后有关DPSCs 的研究基本都采用此类培养模式，但也有学者通过组织块法来培养DPSCs 。

无血清培养可使干细胞进行对称分裂从而得到数量相对较少的干细胞，有血清培养干细胞大部分发生不对称分裂得到数量众多的分化成熟细胞，说明无血清培养可能更适合干细胞的培养扩增。研究采用无血清培养液诱导未纯化的DPSCs 形成神经球，初步表明无血清培养液维持了DPSCs 良

好的克隆增殖效率及分化潜力[4]。随着无血清培养液的研发及对DPSCs 生物学特性认识的深入，应用无血清培养技术体外扩增DPSCs 可以更好地避免其逐渐丢失干细胞特征。

2．2 DPSCs的分选

2．2．1 DPSCs 分子标记 研究和确认干细胞表面的分子标记，是分离鉴定干细胞的重要手段，对DPSCs 的标记物研究还不够深入，目前明确的干细胞标记也不多。迄今为止，发现DPSCs 表达中胚层标记物Stro 一1和CD146。Stro 一1是间充质干细胞(mesenchymal stem cells ，MSC) 的早期细胞标志分子之一，可用于鉴定DPSCs 的未分化状态[5]。Shi 等[3]通过研究发现DPSCs 存在于它们起源组织(颌突上皮和外胚间充质) 的微血管周围，利用Stro 一1能结合牙髓组织血管周细胞抗原的特性分离出DPSCs ，结果显示牙髓细胞中含有大约10％ ～20％ 的Stro 一1阳性DPSCs 。CD146作为免疫球蛋白超家族成员，已知是脉管周内皮细胞抗原标志，DPSCs 也有表达[2-3]。亦有研究发现大部分DPSCs 还表达外膜细胞相关抗原3G5，这些标志分子能用于免疫分选DPSCs [3]。

2．2．2 DPSCs 分选 根据干细胞表面带有或缺乏某些抗原标志，通过免疫选择法之正选择或负选择进行筛选，因而获得相对纯化的干细胞。Shi 等[3]借助免疫磁珠分选系统获得目的细胞DPSCs 。该方法与其它细胞分离技术相比操作更简单，不易污染，不会对细胞造成机械性压力，且不会激活细胞或影响细胞的功能和活力，保持细胞的生理功能不变，同时它可生物降解，不需要去除。因此，分选出的DPSCs 可立即用于纯度分析及下游实验。

也有报道通过多种抗体结合(stro—l +CD146+CD34-CD45-) 的流式分选以获得DPSCs(造血

[6-7]干细胞的表面标记CD34、CD45) 。流式细胞仪分选法虽然能分选得到纯度较高的干细胞，

但其缺点是速度慢，对细胞活性影响较大，分选时不易控制污染，不利于对DPSCs 进行后续培养研究。

采用滤纸片转移法或有限稀释法进行DPSCs 的单细胞克隆分离，平行培养一批单个细胞的克隆，挑选生长旺盛的集落对其表面标志进行鉴定[8-9]。这些方法耗时长、效率较低，获

得大量DPSCs 存在一定困难。

3 DPSCs的生物学特性

3．1 DPSCs的高度增殖和自我更新能力

Gronthos 在体外培养的的第一代DPSCs 和BMSSCs 中加入Brdu 后检测细胞的增生率。结果发现DPSCs 的增生率高于BMSSCs ，DPSCs 约有72％ 阳性细胞，而BMSSCs 约有46％阳性细胞。同时发现DPSCs 的克隆形成率为0．22％～0．70％ ，远高于BMSSCs 的0．024％ ～0．031％ 。

有研究采用验证干细胞的金标准，即体内移植实验，以羟基磷灰石-磷酸三钙(HA／TCP) 陶瓷颗粒为载体，将人DPSCs 植人到免疫缺陷裸鼠背部皮下，6周后病理检测发现了牙本质牙髓复合体样结构，表达牙本质特异性蛋白-牙本质涎磷蛋白(dentin sialophospl1opmtein，DSPP) [10]。通过人(alu)或鼠(pf1)的特异性抗体对细胞表面的CD29标志物反应，利用原位杂交技术从该复合体样结构分离出的大部分间充质细胞对人类的aluDNA 探针显示阳性。把这些间充质细胞在体外扩增后，将人源的细胞再次移植人裸鼠体内，又生成了对人类alu 阳性的成牙本质细胞及牙本质牙髓复合体。再生的牙本质与人的DSP 抗体反应阳性，这些都说明了DPSCs 在体内的自我更新能力。

3．2 DPSCs的多向分化能力

有关成体干细胞的一个重大发现是其具有可塑性(plas-ticity)，即一种组织的特异性干细胞可以分化成发育过程中不相关的其他组织细胞。DPSCs 亦能够分化为脂肪细胞、神经细胞、成骨细胞等多种不同细胞。

3.2.1 成脂诱导分化 Gronthos[10]对DPSCs 进行5周的成脂诱导，出现了油红O 染色阳性的脂滴，利用RT —PCR 方法检测发现脂肪细胞所具有的两种特异性转录因子表达上调。

3.2.2 成神经诱导分化 Gronthos等[10]利用RT —PCR 技术发现DPSCs 在mRNA 和蛋白质水平分别表达神经巢蛋白(nestin)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein ，GFAP) ；Nosrat 等[11]发现DPSCs 为多巴胺能的神经元提供营养支持，而且在体外可分化为神经元，进一步证实了DP-SCS 具有向神经细胞分化的潜能。

3.2.3 成骨诱导分化 研究表明从人类年轻恒牙牙髓中分离培养得到的DPSCs ，在体外诱导下能分化为成骨细胞[12][2]。有学者体外矿化诱导DPSCs 40 d后骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP) 及骨钙素(osteocalcin，OCN) 免疫荧光染色阳性，并可见骨小梁结构，随后将此骨样组织回植免疫缺陷小鼠背部皮下，4周后形成发育良好的板状骨，甚至可见骨陷窝中的骨细胞。

提示DPSCs 在特定的矿化条件下具有成骨能力[13]。

研究证实DPSCs 经条件培养基的诱导可分化为肌细胞、软骨细胞，这无疑又丰富了DPSCs 可分化的细胞谱系 。

4 DPSCs的分化诱导因素

多种细胞因子都对DPSCs 的增殖分化起着重要作用，共同形成DPSCs 生存、增殖和分化的微环境。例如，转移生长因子超家族[15](TGF-beta supefamily) 的主要成员TGF-β1可以促进DPSCs 碱性磷酸酶的表达，以自分泌和旁分泌的形式诱导DPSCs 向成牙本质细胞分化，参与修复性牙本质的形成。在转移生长因子超家族另一重要成员TGF-β3的诱导下,DPSCs 的骨钙素和I 胶原的分泌增加。

骨形成蛋白(bonemorphogenetic protein 2，BMP2) 能够刺激DPSCs 分化为表达DSPP 的成牙本质细胞[16]。有研究表明，体外培养的DPSCs 在成纤维生长因子(fibroblast growth factor 2，FGF2) [17]的诱导下形成牙本质样结构。BMP4同FGF10共同参与上皮干细胞的调节，牙齿的发生是在上皮和间充质的相互诱导作用下完成的，因而，调节上皮干细胞的信号分子可能也会作用于DPSCs ，这问题还需进一步研究探讨。

牙本质基质蛋白-1(dentin matrixprotein 1，DMP 一1) 也可以促进DPSCs 的增殖，对DPSCs 碱性磷酸酶活性的促进作用呈浓度依赖性。更多的研究结果表明：表皮生长因子(epider-mal growth factor ，EGF) 、肿瘤坏死因子α、核心结合因子Cbfa-1和胰岛素样生长因子I 等细胞生长因予亦参与DPSCs 向成牙本质细胞分化过程的调节[18]。

5 DPSCs的应用展望

DPSCs 研究的深入和组织工程学的进展为我们提供了组织修复再生的新思路。作为靶细胞，DPSCs 将促进牙髓组织再生及修复性牙本质形成的因子导入，为牙体牙髓疾病提供了基因治疗的一种途径。在模拟牙胚发育过程中上皮与间充质相互诱导发生的过程中，可能通过诱导种子细胞DP-SCs 形成牙胚，再造牙齿器官[19-20]。

DPSCs 被证实具有多向分化能力[2,21-22]，由于牙髓组织取材相对容易，可用于修复骨组织等。学者在非免疫抑制的大鼠颅顶骨制造5mm ×8mm 骨缺损，人DPSCs 和胶原膜合后移植到缺损区，1个月后发现新生板状骨致密、且和周同骨融合良好；2个月后骨缺损区消失[21]。通过检测DNA 提示新生骨为人源性，证实DPSCs 成骨能力。该实验同时表明人DPSCs 没有激发异种受者的免疫系统产生抗原排斥反应，这对以后的临床应用亦有重要意义。研究将DPSCs 接种

至一种聚合膜上后移植裸鼠背部皮下，60d 后发现含哈弗氏系统及血管的成熟骨，提示DPSCs 不但分化为成骨细胞同时向血管内皮细胞分化[24]。完整的血液供应对于生活组织是非常重要的，DPSCs 将为骨组织的修复提供更多的可能。

但是相比较其他成体干细胞，DPSCs 的研究尚有很大差距。对DPSCs 在牙髓组织中的确切定位等还不完全明确；而DPSCs 的研究手段也面临许多问题，如：DPSCs 数量少、易老化、体外培养扩增难度大、周期长；调控DPSCs 分裂分化为所需要的组织细胞的分子机制，DPSCs 分化的哪个时期最适合移植需要、具有最强的携带治疗药物的能力等问题都未得到解决。这些问题提示DPSCs 应用于临床还要假以时日，随着这些问题的深入探讨和逐个解决，DPSCs 的研究将日趋完善。

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