热休克转录因子1在人肝细胞癌中的表达及转录活性_滕洪飞

热休克转录因子1在人肝细胞癌中的表达及转录活性

滕洪飞

摘

要

目的

宋振顺李煜环范子扬

HSF1）表达量及观察人肝细胞癌组织及对应癌旁组织中热休克转录因子1（heat shock transcription factor 1，

免疫组织化学法及Western blot

转录活性。方法用免疫组织化学方法及Western blot 方法测定30例人肝细胞癌组织及对应癌旁组织中HSF1的表达量及磷酸

化水平，并比较HSF1的表达量及磷酸化水平在肝细胞癌组织及对应癌旁组织中的差异。结果癌旁组织。结论

关键词

HSF1在人肝细胞癌中的表达量及转录活性明显增高。

肝细胞癌

表达

磷酸化

结果显示：①人肝细胞癌组织中HSF1的表达量明显高于对应癌旁组织；②人肝细胞癌组织中HSF1的磷酸化水平明显高于对应

热休克转录因子1

Expression and Transcriptional Activity of HSF1in Human Hepatocellular Carcinoma．

Teng Hongfei ，Song Zhenshun ，Li Yuhuan ，Fan

Ziyang．Department of Hepatobiliary and Pancreato －Splenic Surgery ，Xijing Hospital ，The Fourth Military Medical University ，Shaanxi 710032，China

Abstract

Objective

To observe the expression and transcriptional activity of HSF1in human hepatocellular carcinoma．Methods

The results of immunohisto-The expression and phosphorylation of HSF1in several cases of human hepatocelluar carcinoma tissues and adjacent tissues was detected by immunohistochemical and Western Blot methods．The differences was analyzed between them．Ｒesults

chemical and Western blot suggest．expression of HSF1in human hepatocelluar carcinoma tissues was higher than that in adjacent tissues ，the level of phosphorylation of HSF1in human hepatocelluar carcinoma tissues was higher than that in adjacent tissues too．Conclusion Expression and transcriptional activity of HSF1in human hepatocellular carcinoma tissues were higher than those in adjacent tissues．

Key words

HSF1；HCC ；Expression ；Phosphorylation

10%甲醛稀释液固定做冷冻切片，组织切片厚度为4 8mm ，5min ，室温下自然晾干。检测HSF1表达量及磷酸化时使用SP 法。在癌及癌旁组织切片上加入1ʒ 100稀释的兔抗人HSF1单克隆抗体于4ħ 孵育过夜。PBS 洗涤5min ˑ 3次，加37ħ 孵育30min 后再加入辣入生物素标记的山羊抗兔二抗，

37ħ 再次孵育30min ，PBS 洗涤5min ˑ 3根酶标记链霉卵白素，

次，加入显色剂DAB 显色，自来水冲洗后苏木静衬染。（2）HSF1磷酸化水平：癌及癌旁组织切片上加入1ʒ 100稀释的兔抗人p －HSF1单克隆抗体，其余步骤同前。

3．测定HSF1的表达量：将新鲜的人肝细胞癌组织及对加入ＲIPA裂解液1ml 应癌旁组织各100mg 冰浴中充分匀浆，

4ħ 条件下12000r /min离心30min ，充分裂解10min ，收集上清液并在相同条件下再次离心后取上清液；BCA 法测定蛋白浓度后取相当于40μg 蛋白量的上清液用Western blot 法测定HSF1的表达量。

4．测定HSF1的磷酸化水平：取相当于40μg 蛋白质的上2h ）、2h ）、清液，经电泳（110V ，转膜（130V ，封闭（脱脂奶粉，1．5h ）后加入兔抗人p －HSF1单克隆抗体抗体，4ħ 孵育过夜，加入1ʒ 20000稀释的辣根酶标记山羊抗兔p －HSF1单克隆抗体后检测HSF1磷酸化水平。

作者单位：710032

西安，第四军医大学第一附属医院肝胆外科

肝细胞癌是恶性程度较高的肿瘤，病死率高，耐

［1］

药性强，临床治疗效果差。寻找特异性较高的靶分子实现对肝细胞癌的靶向治疗具有重要意义。本实验通过测定HSF1在人肝细胞癌及对应癌旁组织、肝癌细胞及肝细胞中的表达及磷酸化水平，比较二者存在的差异，探讨HSF1成为治疗肝细胞癌新的靶分子的可能性。

材料与方法

1．材料：新鲜的肝细胞癌及对应癌旁组织各30例取自第四军医大学西京医院肝胆胰脾外科。BCA 蛋白浓度试剂盒、ＲIPA裂解液、PMSF （碧云天），兔抗人HSF1单克隆抗体、兔抗人磷酸化HSF1单克隆抗体（Bioworld Technology．Inc ），辣根酶标记山羊抗兔单克隆抗体（北京鼎国昌盛生物技术责任有限公Sp 两步法试剂盒、司），浓缩型DAB 试剂盒（北京中杉金桥生物ECL Western blot Kit （北京康为世纪生技术有限公司），NC 膜、物科技有限公司）。

2．免疫组织化学染色：（1）HSF1表达量：将新鲜冷冻肝细胞癌组织及对应癌旁组织送往第四军医大学病理科实验室

5．统计学方法：利用Ouantity One 分析软件对Western SPSS 对结果进行统计分析，blot 条带进行分析，盲法半定量

通讯作者：宋振顺，电子信箱：songzs@fmmu．edu．cn

·40·

分析比较免疫组织化学结果，以P ＜0．05为差异有统计学意义。

Western blot 结果表肝细胞癌组织中HSF1表达较高，

现为目标条带较宽，颜色较深（图3A ）；对应癌旁组Western blot 结果表现为目织中HSF1表达相对较低，标条带较窄，颜色较浅（图3B ）。应用Quantity One 软件分析条带并用Origin7．0绘图软件绘图（图4），统计学分析二者比较差异有统计学意义（P =0．002）。（2）HSF1磷酸化水平的测定：肝细胞癌组织中HSF1的磷酸化水平相对较高，表现为对应Western blot 条带颜色较深（图5A ），而癌旁组织中HSF1的磷酸化水平相对较低，对应条带颜色较浅（图5B ），应用Quantity One 软件分析条带并用Ori-gin7．0绘图软件绘图（图6），统计学分析二者比较差异有统计学意义（P =0．008）

。

结果

1．免疫组织化学：采用半定量法统计结果。笔者设定以每高倍视野（10ˑ 40）中阳性细胞数占总细

，＜25%为胞数的百分比作为判断标准：0%为“－”

“+”，25% 50%为“++”，50% 75%为“+++”，＞75%为“++++”，采用盲法统计阳性细胞百分比。结果显示，肝细胞癌组织中HSF1抗体染色呈“++

+”（图1A ），“－”（图1B ）；肝细胞对应癌旁组织中呈（图2A ），癌组织中p －HSF1抗体染色呈“++”对应

“－”（图2B ）。癌旁组织呈

2．Western blot 结果：（1）HSF1的表达量的测定

：

图1免疫组化结果（ˑ 400）

图2免疫组化结果（ˑ 400）

“+++”，肝细胞癌组织中HSF1的表达为对应癌旁组织中HSF1“－”。图中黑色箭头指示的黄染的细胞为HSF1抗体染表达为色阳性

“++”，肝细胞癌组织中HSF1的磷酸化水平为对应癌旁组织中HSF1表达为“－”。图中箭头所指细胞为p －HSF1抗体染色阳

性细胞

图3Western blot 结果

A．肝细胞癌组织中HSF1的目标条带（75kDa 条带）及内参（43kDa ）；B．

对应癌旁组织中目标条带及内参

讨论

HSF1是一种存在于真核细胞胞质中的蛋白质分子，其结构和功能高度保守。HSF1在进化上有两个高度保守的结构域，即位于N 端的DNA 结合区域（DNA －binding domain ，DBD ）和含有数个疏水亮氨酸拉链的三聚化结构域（trimerization domain ）。DBD 的三维结构为螺旋－转角－螺旋结构基元（helix －turn －helix motif ），该结构具有DNA 结合蛋白的特征性。三聚化结构域由3个疏水七氨基酸重复序列的

图4

HSF1/β－actin 比值横、纵坐标分别为标本号、

螺旋环结构形成的，主要功能为调节HSF1的活化。

HSF1在机体正常发育成熟过程中不可或缺，研究表明缺失HSF1导致果蝇卵子发育异常以及小鼠胚胎发育缺陷

［2，3］

红、绿色柱状图分别代表肝细胞癌后对应癌旁组织中经消除背景色彩后目标条带与β－actin 的灰度值之比。图4中我们可以看出二者P =0．002之间存在统计学差异，

。

·41·

·论著·

J Med Ｒes，Oct 2013，Vol．42No．

10

图5Western blot 结果

A．肝细胞癌组织中p －HSF1的目标条带及内参；B．

对应癌旁组织的目标条带及内参

该过程中HSF1的转录活性与其转录活体移至胞核，

化结构域中磷酸化位点的高度磷酸化相关，即HSF1

［12，13］

。实验中我们活化后其磷酸化水平会明显增高

发现在肝细胞癌组织中HSF1磷酸化水平明显高于

对应癌旁组织，二者比较差异有统计学意义（P =0．008），提示HSF1在肝细胞癌中的转录活性增强。我们的研究显示肝细胞癌组织中HSF1的表达量及转录活性明显增高，提示HSF1可能与肝细胞癌但是HSF1通过何种机制促进肝细的发生发展相关，

［14］

胞癌的发生发展目前仍不清楚。Zou 等报道HSP90在胞质中与HSF1单体结合，阻止其三聚体形

［15］

成，从而起到抑制HSF1活性的作用。Ali 等向爪蟾卵母细胞中注射HSP90抗体引起HSF1与HSE 结

该过程能被注射纯化的HSP90逆转。Chen 合增强，

等实验发现HSP90抑制剂联合HSF1基因敲除可明显抑制多种肿瘤细胞生长，其中包括肝癌细胞。上述报道提示在HSF1的活化过程中HSP90对HSF1的抑制功能可能受到破坏，从而使HSF1在细胞内转录活性增强。多种因素可以引起HSP90抑制功能受损，如肿瘤细胞中某种或某些分子合成大量增加，竞争结合HSPs ，或者是产生了能与HSF1上HSP 结合位点结合能力较强的分子等。据此我们推测：在肝细胞癌中某种或某些分子合成增加，竞争性地结合HSP90或HSF1从而达到阻断HSP90对HSF1的抑制作用。进一步研究HSF1在肝细胞癌发生发展中的作用机制是我们今后的研究方向，深入探讨其成为治疗肝细胞癌特异性靶分子可能性具有较大的临床价值。

参考文献

1

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图6HSF1/β－actin 比值横、纵坐标分别为标本号、

红、绿色柱状图分别代表肝细胞癌后对应癌旁组织中经消除背景色彩后目标条带与β－actin 的灰度值之比

HSF1不但在机体的正常发育过程中有重要作其表达量的异常还与多种恶性肿瘤的发生及恶性用，

［4］

程度相关。Hoang 等首先发现HSF1与人前列腺癌发生相关，在此基础上Tang 等

［5］

发现在恶性程度

HSF1表达水平越高。此后越高的前列腺癌组织中，

［6 8］

多篇文献相继报道HSF1与恶性肿瘤如散发性胃肠癌，乳腺癌，多发性骨髓瘤相关，但是HSF1在肝细胞癌的发生发展过程中是否起作用国内外报道较

［9］

少。李讳等报道肝细胞癌组织中HSF1mＲNA表达Jin 等水平高于对应癌旁组织，

［10］

发现肝细胞癌发展

Fang 等［11］报道体过程中HSF1是一个重要的因素，

外实验发现HSF1促进肝细胞癌的侵袭和转移。因

此，研究HSF1的表达及活性在肝细胞癌发生发展的作用对于诊断及治疗肝细胞癌具有重要潜在的临床价值。

本研究采用自体配对设计，很好地避免了因个体差异而导致的选择偏倚。实验中我们应用免疫组织化学及分子生物学方法测定并比较人肝细胞癌及对应癌旁组织中HSF1的表达量，结果显示肝细胞癌组织中HSF1的表达量明显高于对应癌旁组织，二者之间有统计学意义（P =0．002），提示HSF1可能与肝细胞癌的发生相关。

HSF1在胞质中以无活性单体状态正常情况下，

存在，当机体应激时HSF1迅速被激活并转变为三聚·42·

医学研究杂志2013年10月

4

第42卷第10期

11

·论著·

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（收稿日期：2013－04－17）（修回日期：2013－05－07）

910

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CD4CD25FoxP3调节性T 细胞在小鼠H22

原位肝癌模型中的表达和意义

林秀清

摘方法

要

目的

+++

黄智铭王剑虹蔡勇张豪吴金明吴建胜

+++

检测小鼠原位肝癌模型中CD4CD25FoxP3调节性T 细胞的表达，探讨其在肝癌免疫中的作用。

Balb /C小鼠随机分为肝癌模型组、生理盐水对照组、空白对照组各10只，采用细胞悬液直接注射法制成原位肝癌模型。

+++

肝癌模型组肿瘤组织CD4CD25T /CD4T 细胞的比例增高，与肝癌模型组

++

模型制作后第30天处死动物：流式细胞术检测分离纯化后的各组新鲜肝组织和脾脏CD4CD25T 细胞的相对比例；实时ＲT－

PCＲ检测各组肝组织FoxP3基因表达水平。结果

癌旁远端组织、生理盐水对照组肝组织、空白对照组肝组织比较，差异有统计学意义（P ＜0．05），而各对照组之间的比例差异无

+++

统计学意义（P ＞0．05）。肝癌模型组脾脏CD4CD25T /CD4T 细胞的比例增高，与生理盐水对照组脾脏、空白对照组脾脏比

较，差异有统计学意义（P ＜0．01），而各对照组之间的比例差异无统计学意义（P ＞0．05）。肝癌模型组肿瘤组织FoxP3mＲNA的表达水平高于肝癌模型组癌旁远端组织、生理盐水对照组肝脏组织和空白对照组肝脏组织，差异有统计学意义（P ＜0．01），而各对照组之间FoxP3mＲNA的表达水平差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论胞免疫起抑制作用。

关键词

肝癌模型

Treg 细胞

CD4+CD25+调节性T 细胞

FoxP3

Treg 细胞在小鼠原位肝癌模型中表达升高，且对细

Expression and Its Significance of CD4+CD25+FoxP3+T ＲegulatoryLymphocytes in H22Orthotopic Tumor Model of Hepatocellular Carci-noma in Mice．

Lin Xiuqing ，Huang Zhiming ，Wang Jianhong ，Cai Yong ，Zhang Hao ，Wu Jinming ，Wu Jiansheng．Department of Gas-

troenterology ，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College ，Zhejiang 325000，China

基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（Y2090660）作者单位：325000

温州医学院附属第一医院消化内科（林秀清、黄智铭、王剑虹、张豪、吴金明、吴建胜），移植科（蔡勇）

通讯作者：黄智铭，电子信箱：wyyyhzhiming@126．com

·43·