DNA 探针技术
DNA 探针技术
一、DNA 探针技术的主要内容
两条不同来源的核酸单链如果在一定区段具有互补的碱基序列, 或者说具有一定的同源性, 就可以特异地结合, 形成双链杂种分子, 这种合称为核酸分子杂交。如果用已知核酸(通常是DNA) 片段作为探针, 通过与未知核酸(DNA或RNA) 样品进行杂交试验, 根据两者杂交状况的分析, 就可以确定它们同源性程度, 检测特定核苷酸序列在样品中的存在及含量。这便是D N A 探针分析的基本原理。按照单链核酸样品所处的状态, 核酸分子杂交一般区分为液相杂交、固相杂交和原位杂交三类, 目前应用较 遍的是后两类。固相杂交中, 对DN A待测样品用限制性内切酶水解, 得到的各片段按子量大小经凝胶电泳分离, 变性(解旋) 成单链后通过毛细管现象从凝胶吸印到硝酸纤维薄膜上, 固定后即可与DNA 探针迸行杂交试验。此法因其发明者命名为s o u t h e r n 印溃杂交。按照相似的原理与操作步骤分析R NA 样品, 则称No r-the r n印渍杂交 (No rthe r n是对应So u the r n所起的趣名, 不是指发明者的姓氏) 。固相杂交另法, 是把核酸样品变性后, 用点状加样法固定在硝酸纤维薄膜上, 再DNA 探针杂交, 这称为斑点杂交。原位杂交指不改变待测核酸在细胞内原始位置,DNA 探针与固定在组织、细胞或染色体的核酸样品进行杂交的方法。菌落或噬菌斑杂交, 是把生长在培养基平板上的菌落或噬菌斑按其原来位置不变地转移到薄膜上, 并在原位发生溶菌、D NA变性和杂交过程, 所以属于原位杂交类型。
针对不同分析对象选择不同杂交方式, 可以满足核酸分析不同要求, 拓宽了D NA探针的应用范围。
二、DNA 探针技术的主要应用
1. 用于墓因工程和分子生物学研究
作为生物技术核心的基因工程(重组DNA 技术) 是 7 0年代兴起的、按人们意愿定向改造生物遗传性状的高技术。其主要步骤是取得目的DNA, 与载体DN A体外重组, 将重组DNA 分子导人宿主细胞, 筛选能够表达重组DNA 的细胞加以传代扩增。这中间筛选步骤, 就可以用DNA 探针进行菌落或噬菌斑原位杂交来完成。分子生物学研究中凡涉及核酸的定位、定量及序列分析等方面的工作, 诸如染色体基因定位, 基因突变及不同种属间基因变异的研究, 细胞中 mRNA(信使核糖核酸) 转录过程的研究, 以及探讨病毒、肿瘤基因和细胞癌变之间可能存在的关系等, 都需要应用DNA 探针技术。
2. 用于检测病原徽生物及寄生虫
对于人体或环境中存在的细菌、病毒微生物, 现行检测方法既费时又不够准确。如果用特异的DNA 探针检测微生物包含的核酸片段, 不但灵敏快速, 而且特异性强, 甚至可以分析同种异株间的区别。
D NA探针推广至微生物检验上, 对于诊断传染病、开展流行病学研究将有重要意义。例如乙型肝炎是危害我国人民健康的大敌, 现在已开发DNA 探针法检测乙肝病毒D NA的技术, 比现行的免疫学检验
结果更灵敏可靠, 是普查乙肝传染的强有力手段, 该技术正在国内普及推广。此外,DNA 探针还可以应用于对利什曼原虫病、疟原虫病等寄
生虫感染疾病的诊断。
3. 用于普变和诊断遗传性疾病
人类和动物的遗传性疾病是由于基因DN A 的缺陷经遗传引起的。目前已知的三千多种遗传性疾病中, 只有很少一部分可以通过检测基因的表达产物(蛋白质或酶) 的改变予以诊断。用D NA探针可以在D NA 水平分析基因结构的缺陷, 突破依靠基因的蛋白产物进行诊断的局 限。对于因为基因内点突变或基因部分缺失、重排或插人而引起的遗传性疾病, 可以用D NA探针进行Souther n印渍杂 交直接加以分析诊 断。对于那些尚不明其原发的基因缺陷的遗传性疾病, 则需要用DN A 探针技术分析限制性片段长度多态性, 以此作为遗传标志作出分析诊断。总之,DNA 探针技术有助于开展产前断或遗传咨询、携带者普查, 为防治遗传性疾病开辟了新路。
4. 用于法医物证学
人类染色体中存在许多分散的具有串联重复单位的微小卫星区。利用人体卫星区DN A 作探针检测不同生物卫星区, 产生相应的 D N A 指纹图谱, 这是由Jeffe ys等在1 9 8 5年首创, 随后几年 中迅速获得发展完善的DNA 指纹图谱法新技术。法医学中进行个人识别, 可以对犯罪现场的血迹或衣物上残留的体液干斑进行DNA 指 纹测定, 经核对指纹档案便可判断案情。D N A指纹图谱法还可用于亲权鉴定、血液种属区别和性别鉴定等工作。