蛋白质提取.纯化.鉴定的方法(一)
蛋白质提取、纯化、鉴定的方法（一）
一、硫酸铵沉淀 硫酸铵是用于沉淀蛋白质的最常用的盐。低浓度硫酸铵使蛋白质的溶解度增大，即所谓的盐溶(salting in)，但当硫酸铵浓度增加到一定浓度后，蛋白质的溶解度开始减小，即所谓的盐析(salting out)。当硫酸铵达到一定浓度时，蛋白质析出。不同蛋白质的盐析浓度有差异，了解目的蛋白质析出所需的硫酸铵浓度，就可部分纯化这种蛋白质。注意，目的蛋白质的浓度与盐析浓度有一定的关系，如1mg／ml与0.01mg／ml的蛋白质浓度所需的盐析浓度是不一样的，低浓度的蛋白质盐析需要较高浓度的硫酸铵。硫酸铵沉淀不仅可去除一些杂蛋白，还可去除其他的杂质如脂质等各种小分子。
二、三相分配技术
举一个例子来说明该技术的原理：提取E.coli中的绿色荧光蛋白，E.coli与适当浓度的硫酸铵混匀，加入等体积的叔丁醇，振荡混匀，低速离心，分成三相。上层为有机相，含有细菌的膜脂和脂溶性物质如色素；中层，含有绿色荧光蛋白；下层为相，含有完整细胞壁的E.coli、核酸和大量的蛋白质等。
这个技术的原理是，适当浓度的硫酸铵可沉淀大量的蛋白质但不沉淀绿色荧光蛋白；叔丁醇可溶解细菌的细胞膜，因此可释放绿色荧光蛋白；同时叔丁醇是种有机溶剂，可使蛋白质和核酸等大分子变性，使其在原位沉淀，仍留在细菌的细胞壁内。
该方法的优点是操作简便，省去了消化细胞壁和去除核酸及大多数杂蛋白等烦琐步骤。但该方法只适用于那些能够耐受有机溶剂的蛋白质。这样的技术得到的是部分纯化的蛋白质。
三、层析技术
1.离子交换层析 这一技术是根据不同的蛋白质有不同的等电点，其吸附在离子交换剂上的强弱有分别，来对蛋白质进行分离。离子交换剂可分为两种，阳离子交换剂(如羧甲纤维素)和阴离子交换剂(如DEAE-纤维素)。在某一pH值条件下，当阳(阴)离子交换剂带有负(正)电荷而蛋白质带有正(负)电荷时，蛋白质就可吸附在阳(阴)离子交换剂上。各种蛋白质的等电点可能不同，因此其吸附在离子交换剂上的强度不同，用不同离子强度的洗脱液可将pI不同的蛋白质洗脱。要注意的是pI相近的蛋白质很多，因此用此方法提取的目的蛋白质不一定是纯的。在使用离子交换剂时，必须知道离子交换剂的pKa值，如羧甲基的pKa值是
4．5，这说明当流动相的pH为5. 5时，90％羧甲基与质子基本解离，带负电，然而当流动相pH为5. O时，羧甲基与质子开始结合，当pH到达4．0时，羧甲基质子化，不带电，失去离子交换功能。当然，还必须知道目的蛋白质的等电点。实验者若要做好离子交换层析，必须了解离子交换层析的详细原理和操作规范。
2.聚焦层析 聚焦层析是一种离子交换层析，与普通的离子交换层析不同的是洗脱方法。普通的离子交换层析是用变换流动相的离子强度来洗脱蛋白质，而聚焦层析是用pH梯度来洗脱蛋白质。洗脱液用高分子缓冲液(polymeric buffer，如ampholytes)，amloholytes可非常好地控制pH的洗脱梯度。理论上，pI相差0．05的蛋白质也可以被分开。
3.亲和层析 亲和层析是一种非常有效的层析方法，基于蛋白质，配体(如抗体、抗原、受体、激素、酶、底物、酶，抑制剂等)分子之间的特异结合性。将一种配体交联到固相载体上，理论上就可以提取混合物中的目的蛋白质。在用亲和层析纯化时，必须首先考虑抗体，抗原、受体、激素、酶、底物等的解离常数(Kd)，Kd一定要小于0．003mM。当Kd小于0．003mM时，95％，的酶、抗体或受体等会吸附在亲和吸附剂(affinity adsorbents)上。洗脱时，流动相中的底物(配体)对酶(受体)的亲和性往往大于固定相中的底物(配体)，因此可以有效洗脱。有时，若配体不易获得或非常昂贵，也可以用其他方法洗脱，如增加离子强度，破坏目的蛋白质与其配体之间的离子相互作用，但增加离子强度可增强目的蛋白质与固相吸附剂的疏水吸附，因此可以加一些表面活性剂如TritonX-100降低目的蛋白质与固相吸附剂的疏水吸附作用。有些目的蛋白质与亲和吸附剂的相互作用非常强，很难洗脱，可以加一些离液剂(chaotropic agent)如尿素。