油菜根系分泌物的GC-MS 检测方法研究

农业资源与环境学报

Journal of Agricultural Resources and Environment

油菜根系分泌物的GC-MS 检测方法研究

张

红，高亚军，安

蓉

（西北农林科技大学资源环境学院，农业部西北植物营养与农业环境重点实验室，陕西杨凌712100）

本文采用水培试验，利用CH 2Cl 2提取油菜幼苗的根系分泌物，要：为筛选建立BP-5MS 毛细管柱检测油菜根系分泌物的方法，

摘

分阶段细化升温程序，检测出来的特征峰较通过GC-MS 检测分离鉴定。结果表明，根据待测物质组分性质，采用合适的溶剂延迟，醇类、酯类和酸类化合物，且烃类和醇多且分布密集，特征峰分离相对比较好。从检测结果看，油菜苗期根系分泌物主要包括烃类、对植物在逆境环境中的生长和发育有一定的影响。类化合物的相对含量较高，这些物质大多数具有化感作用，GC-MS ；关键词：油菜；根系分泌物；化感作用X830.2中图分类号：

A 文献标志码：

2095-681903-0290-06文章编号：（2014）

doi:10.13254/j.jare.2013.0209

Testing Method of Rape Root Exudates by GC-MS Analysis

（College of Resources and Environment, Northwest A&FUniversity, Key Laboratory of Plant Nutrition and Agri-environment in Northwest China, Yangling 712100, China ）

Abstract ：In order to establish a method for the detection of rape root exudates, the hydroponic experiment was conducted using CH 2Cl 2ex - ZHANG Hong, GAO Ya-jun, AN Rong

tract to detect, isolate and identify root exudates of rape seedlings by GC-MS. The results showed that the detected peaks had more densely distributed and relatively good separation of peaks according to the composition of the testing substance by using a suitable solvent delay stages and refining temperature program. From the results, rape seedling root exudates included hydrocarbons, alcohols, esters and acids, tain impact on the environment in adversity plant growth and development. Keywords ：rape; root exudation; GC-MS; allelopathic effect

while compounds of hydrocarbons and alcohols had relatively high levels. Most of these substances had allelopathic effects which had a cer -

除溢泌质子和其他植物根系在生长发育过程中，

无机离子外，还不断向生长介质中释放大量有机物

土壤质，即根系分泌物。根系分泌物在土壤结构形成、促进植物养分吸收、根系土矿物风化、土壤养分活化、壤养分移动及环境胁迫缓解等方面都具有重要作

其种类和数用[1-6]。由于植物根系分泌物的组分复杂，

量随植物类型、根际环境而异。对根系分泌物的研究生物污染胁迫、环是土壤形成、植物营养、化感作用、受到国内外学者境污染修复等研究领域的重要内容，的普遍关注[7-8]。

根系是连接植物、土壤及土壤微生物的桥梁和纽

2013-11-21收稿日期：

基金项目：西北农林科技大学大型仪器设备新功能开发项目（dysb130

201）；黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国家重点实验室（K318009902-1310）

在读博士，作者简介：张红（1981—），女，陕西韩城人，实验师，研究

方向为环境化学与土壤化学。

E-mail:zhanghong [email protected]

带，植物根系在正常生长过程中会向根际排泄大量的

这分泌物，其中含有许多具有生物活性的化学物质，些物质不仅影响植物根际微生态环境，还影响植物

同时表现出多种根系周围有机体和其他植物的生长，

形式的化感作用[9-12]，所以深入研究植物根系分泌物

提纯方法和的种类、影响因素及根系分泌物的分离、功能，对根系分泌物的形成及其作用机理具有重要意义[13-15]。采集根际土壤研究植物的根系分泌物是比较直接的方法，其结果最接近于植物自然生长状态下的根系分泌物组成特点，但这种方法难于把根系分泌

物与土壤中的其他物质完全分离，容易受到其他外源物质的影响[16]。而溶液收集法是通过植株的液体培

从而确定根系释放物养，分析其溶液中的物质组成，质组成的方法[17-18]。虽然这种方法不能完全接近于自但却容易排除外来然状态下的根系分泌物组成特点，

物质的干扰，对于研究植物的根系分泌物组成有重要

意义。

—290—

张等：红，油菜根系分泌物的GC-MS 检测方法研究

是对水分敏感的油菜是我国主要油料作物之一，

根系首先引起形态和作物，在不同养分供应水平下，以便吸生理特征变化，来适应不同的养分供应环境，

收更多的养分，这些变化必然会影响作物产量[19]。在环境胁迫下，油菜在苗期尤以对外界环境的变化反应最为敏感[20]。近年来，在根系分泌物的研究过程中用到多种仪器手段，如分光光度法测定铝胁迫下外源有机酸对油菜根系分泌物特性[21]，液相色谱法测定根系分泌物中的有机酸[22-24]，而应用GC-MS 通过数据库检索鉴定植物根系分泌物的手段越来越广泛[25-26]。GC-MS 充分联合发挥了色谱仪的高分辨率和质谱仪灵敏度高，能对待测组的高鉴别能力，具有需样量小、

不少学者利用它检分的功能团进行有效鉴定等优点，

测不同植物根系分泌物的组分和化合物种类[27-29]。目

很多学者前对油菜根系分泌物方面的研究报道不多。

利用GC-MS 研究根系分泌物，因根系分泌物的组分属性不同，大多数研究采用极性或弱极性毛细管柱分离检测其有效成分，且毛细管柱的规格也不尽一致，因此检测结果略有不同。本研究以水培的油菜植株为材料，利用化学溶剂CH 2Cl 2浸提，在减压状态浓缩

120℃ 烘干至恒重止，再用去离子水冲洗至pH 稳定，

营养器采用10L 的圆形塑料桶，带孔后作培养基质。

塑料泡沫板作盖板。试验设3次重复，供试化学药品均为分析纯。本试验在西北农林科技大学人工气候室内进行。1.2溶液培养

温度为20~ 25℃ 避光发芽，当根长至2~ 3cm 英砂中，

用去离时，进行溶液培养，小心取出生长均一的幼苗，

置于Hoagland 营养液中定植，子水轻轻洗去石英砂，

每孔定苗1株，每周更换1次，以保证幼苗正常生长。

每桶定苗10株，一共20桶。采用自动定时小型通气泵连续通气。

1.3根系分泌物的收集

供试营养液为Hoagland 营养液。供试种子经H 2O 2表面消毒后播于用CaSO 4溶液浸泡过的备用石

后，选用BP-5MS 毛细管柱分离油菜苗期根系分泌物。由于BP-5MS 柱兼有非极性柱与极性柱的优点，对非极性柱流失低，且在检测分离过程中相对稳定，

醚等成分有较好的分离的烃类组分及中等极性的酯、

建立油菜苗期根系分效果，以此摸索优化检测条件，

泌物的测试方法，为此类研究工作提供参考。

（过夜）酸钠干燥处理，再将处理过的提取液过0.22μ m

膜，提取液用作GC-MS 上机测定。1.4根系分泌物的分离鉴定

样品提取好后，在西北农林科技大学资源环境学院实验教学中心色谱分析仪器室中运用GC-MS 测定完成。仪器型号为Thermo Fisher Trace GC 2000DSQII ，30m × 0.25mm × 0.25μ m ，载毛细管柱BP-5MS ，气为He ，采用不分流进样。

根据杨瑞吉等[15]、柴强等[29]研究方法分别选择以

具下参数条件进行测定，并从中优化建立测定方法，

体见表1。

为了避免每个样品测定结束对下个样品测定带

用250mL CH 2Cl 2提取根洗液培养4h （9:00—13:00），

3~ 4次，减压浓缩至1~ 1.5mL 左右，用烘干的无水硫

移栽至2L 0.5将水培生长到抽薹期的油菜植株，mmol L -1的CaCl 2溶液中，·在温室光线良好的条件下

1

1.1供试材料

（Brassica campestris L. ）用供试油菜为华协1号。

材料与方法

10%的盐酸浸泡石英砂1周，用水冲洗至无氯离子为

表1GC-MS 测定油菜根系分泌物的不同检测方法

参数设定进样口温度/℃ 升温程序进样量/μ L min -1流量/mL·扫描模式溶剂延迟/min电子轰击源/eV离子源温度/℃ 传输线温度/℃

方法1250

50250℃ （15min ）1

全扫描33~453m/z

3702502501

方法2250

50250℃ （15min ）1

全扫描33~453m/z

5702502501

方法3250

℃ （1min ）[1**********]

全扫描33~453m/z

—291—

·农业资源与环境学报第31卷·第3期

来干扰，特设高温老化检测柱程序，

将残留在柱子中的样品高温烧掉。每种方法最后得出的GC-MS 谱图应用NIST2009质谱数据库，通过计算机检索进行未知物以及相对含量的测定。

2

2.1油菜结果与讨论

3种根方系法的分泌测物试结果见图GC-MS 扫描1~图图谱

3。

100903.04

41.27

807030.95

50.0357.9163.39

[1**********]017.90

10

20

3040图1方法1测定油菜苗期Time/min

50

60

根系分泌物的GC-MS 扫描图谱Figure 1Determination exudation of GC-MS by Method scan 1

graph of rape root

1009052.59

8060.94

706039.52

42.32

504030205.04

100

15.7223.87

010

20

图2方法2测定油菜苗期根Time/min

3040

50

60

系分泌物的GC-MS 扫描图谱Figure 2Determination exudation of GC-MS by Method scan 2

graph of rape root

图1可以看出，

方法1中由于溶剂延迟设定的时间过短，

3min 后出现较强的溶剂峰，对样品检测结果影响较大，所以必须加长溶剂延迟的时间。

方法2中升温程序相对比较简单，

而根系分泌物的组分复杂。从图2可以看出，

通过该方法测定得出的总离子流谱图发现，前期基本不出峰，后期出峰较多，且峰与峰之间分离较差，基线漂移较高，不能得出很好的结果。—292—

1009036.59807033.56

39.51

605030.41

403023.87

27.1742.31

205.0420.54

45.03

1050.1758.630

10

20

Time/min

3040

50

60

图3方法3测定油菜苗期根系分泌物的GC-MS 扫描图谱Figure 3Determination exudation of GC-MS by Method scan 3

graph of rape root

方法3中将升温程序进一步细化，

通过加快升温速率把前期不出峰时段简单略过，

然后再减慢升温速率，使后期组分相对复杂的峰形得以更好的分离。从图3可以看出，在油菜苗期，根系能分泌大量有机化学物质，检测出来的特征峰较多且分布密集，

特征峰分2.2离油菜相对通过根比3系较好种分方泌，基法物线之GC-MS 漂移不大间的比较鉴，

定，

结果可信。方结果

法3所得出的结果比较好，说明GC-MS 用BP-5MS 毛细管柱建立检测油菜根系分泌物的方法是可取的。BP-5MS 毛细管柱兼有非极性柱与极性柱的优点，

对非极性的烃类组分及中等极性的酯、醚等成分有较好的分离效果。将图3的质谱图经NIST2009谱库检索和分析，确定了油菜

在苗期的根系分泌物的化学成分，

分析结果见表2。由表2可见，油菜根系分泌物的CH 2类Cl 2提取物

共鉴定出44种有机化合物，主要包括烃、

醇类、酯类和酸类化合物，其中烃类有34种，醇类有6种，酯类有3种，酸类1种，且烃类和醇类化合物的相对含量22.60%较高。7.33%，十，而六其在烷次烃4.28%是类二中，十二，

2-一十甲烷烷基7.97%的相对十八烷，9丰4.20%-度己最高基。十，由七达到

此烷见，油菜苗期的根系分泌物主要以结构较简单的直链可或支链烷烃为主，结构相对复杂的醇、酯、酸类有机化合物较少，而烃类、酸类和酯类本身或者其次生代谢的产物具有一定的化感作用，包括抑制或刺激其他作

物种子的萌发以及对土壤中微生物的影响[18，30]，这和

杨瑞吉等[15]的研究结果是一致的。由于油菜苗期的根系分泌能力较强，可以通过加强根系代谢来调控自身生理变化，适应周围环境。

本试验共设3个重复，每个重复之间的总离子流

张等：红，油菜根系分泌物的GC-MS 检测方法研究

表2油菜苗期主要根系分泌物鉴定结果

类别烃类

化学名称4-环己基十一烷3-甲基十三烷5-丙基十三烷

英文名称Undecane,4-cyclohexyl-Tridecane,3-methyl-Tridecane,5-propyl-

1.130.331.343.710.851.030.510.562.351.344.280.911.193.520.627.330.630.954.200.39类别烃类

化学名称

3-乙基-5-（2-乙丁基）十

八烷

2-甲基十九烷3-甲基十九烷9-甲基十九烷

二十烷2-甲基二十烷

英文名称

ethylbutyl ）-Nonadecane,2-methyl-Nonadecane,3-methyl-Nonadecane,9-methyl-Eicosane Eicosane,2-methyl-Eicosane,3-methyl-Eicosane,7-hexyl-Heneicosane

Area/%0.980.7022.600.740.920.380.940.84

2,6,10-三甲基十四烷4-二乙基十四烷

十五烷2-甲基十五烷2,6,10-三甲基十五烷8-己基十五烷

十六烷3-甲基十六烷7-甲基十六烷

十七烷3-甲基十七烷9-己基十七烷9-辛基十七烷2-甲基十八烷5-甲基十八烷3-甲基十五烷

Tetradecane,2,6,10-trimethyl-Tetradecane,4-diethyl-Pentadecane

Pentadecane,2-methyl-Pentadecane,2,6,10-trimethyl-Pentadecane,8-hexyl-Hexadecane Pentadecane,3-methyl-

3-甲基二十烷7-己基二十烷二十一烷

10-甲基二十烷11-（1-乙烷基丙基）二十

一烷

醇类

2-（十八环氧基）乙醇2-苯基-2-丙醇2-甲基1-十六醇叔十六硫醇柏木醇2-己基-1-辛醇17-三十五烷

Eicosane,10-methyl-Heneicosane,11-（1-ethylpropyl ）-Ethanol,2-（octadecyloxy ）Benzenemethanol, à , à -dimethyl-1-Hexadecanol,2-methyl-Tert-Hexadecanethiol

Cedrol 2-Hexyl-1-otcanol 17-Pentatriaconten

7.972.061.151.190.391.013.613.660.850.500.440.260.94

Hexadecane,3-methyl-Hexadecane,7-methyl-Heptadecane,3-methyl-Heptadecane,9-hexyl-Heptadecane,9-octyl-Heptadecane

2,6,10,15-四甲基十七烷

Heptadecane,2,6,10,15-tetramethyl-Octadecane,2-methyl-Octadecane,5-methyl-酯类戊酸,5-羟基-2,4-二-叔丁Pentanoic acid,5-hydroxy-2,4-di-t-butylphenyl esters 基苯基酯

亚硫酸丁基脂

7-甲基-Z-十四烯-1-醇酯7-Methyl-Z-tetradecen-1-olacetate

二十六烷基醋酸

Hexacosyl acetate

Sulfurous acid,butyl tridecyl

ester

酸类

强度在3.11× 108~3.12× 108之间，出峰时间与峰面积重复度达到100%，整体误差率不超过3%，所以结果准确可靠。

物质或其次生代谢产物具有一定的化感作用。

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3结论

图谱通过比较发现方法3中设定的参数比较合理，

特征峰分离相中检测出来的特征峰较多且分布密集，

表明用GC-MS 法和BP-5MS 对比较好，基线漂移不大，毛细管柱对检测分离油菜根系分泌物的效果较好，重现性高，其精密度和准确度都能满足油菜根系分泌物

的测定要求，结果可信。从分析结果看，油菜苗期根系分泌物主要包括烃

且烃类和醇类化合物的类、醇类、酯类和酸类化合物，相对含量较高，说明油菜苗期的根系分泌物主要以结

构较简单的直链或支链烷烃为主，结构相对复杂的且这些分泌物中的多数醇、酯、酸类有机化合物较少，

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