保加利亚乳杆菌菌粉生产工艺研究
生物工程
FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY
食品科技
2009年第34卷第7
期
保加利亚乳杆菌菌粉生产工艺
研究
付艳茹，靳
烨*
(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特010018)
摘要：通过对保加利亚乳杆菌NQ-2508菌株的培养基、培养条件、生产工艺、冷冻干燥保护剂
及保存条件进行研究，结果表明：发酵培养基MRS中主要物质最佳组合为葡萄糖2%+酪蛋白胨1%+牛肉浸膏1%+酵母粉0.5%，最佳生长温度为37℃，发酵终点pH值为4.70~4.80。冷冻干燥保护剂最佳组合为海藻糖10%+蔗糖8%+L-半胱氨酸1%+谷氨酸钠1%，通过菌粉生产中试，获得了活菌数达到5.0×1010cfu/g以上的冻干菌粉。并确定该菌粉适宜在低温条件下保存，为直投式酸奶发酵剂产业化生产打下了基础。
关键词：保加利亚乳杆菌；培养基；活菌数；生产工艺
中图分类号：TS201.3
文献标志码：A
文章编号：1005-9989(2009)07-0014-04
StudyforproductionprocessofLactobacillusbulgaricuspowder
FUYan-ru,JINYe*
(FoodScienceandEngineeringCollege,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,
Huhhot010018)
Abstract:Inthispaperwestudytheoptimalmedia,growthcondition,productprocess,lyophilizedprotective
andpreservationconditionforLactobacillusbulgaricusNQ-2508,anddeterminedtheoptimumcombinationofmaincompositionsinMRSbrothbyorthogonaldesignis2%(w/v)glucose,1%(w/v)caseinpeptone,1%(w/v)beefextract,0.5%(w/v)yeastextract.WealsodeterminedtheoptimalgrowthtemperatureofNQ-2508is37℃andterminalpHof4.70~4.80,theoptimalcombinationoffreeze-dryingprotectiveagentis10%(w/v)trehalose,8%(w/v)sucrose,1%(w/v)L-cysteine,1%(w/v)sodiumglutamate.WeobtainedthepowderoflyophilizedLactobacillusbulgaricusthroughproductionpilotscaletestandviablecellcountwasabove5.0×1010cfu/g,anddeterminedtheproperpreservationconditionwaslowtemperature.Thisstudylaidafoundationofcommercialproductionoffreezedryingyoghurtstarter.
Keywords:Lactobacillusbulgaricus;properbroth;viablecellcount;productionprocess
保加利亚乳杆菌在分类学上属于德氏乳杆菌保加利亚亚种，在食品和药品中都得到了非常广泛的应用[1]。保加利亚乳杆菌是制作酸奶所用发酵
收稿日期：2008-12-21
剂的主要菌株之一。近些年来，随着我国乳品工业的发展，沿用多年的液体酸奶发酵剂和需要活化使用的冷冻干燥发酵剂已不能适应生产的要求。
＊通讯作者
基金项目：内蒙古自治区乳业重大科技专项(20050201)。
作者简介：付艳茹(1964—)，女，高级工程师，研究方向为畜产品安全生产。
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为了保证酸奶质量，避免因发酵剂的传代操作造学手册》
中所列保加利亚乳杆菌的最适生长温度为成的菌种退化和污染，国内的大型乳品生产企业38~40℃，但不同菌株因来源不同和个体差异的原都花费重金从国外进口直投式酸奶发酵剂[2]。因而因而可有不同的最适生长温度。
研究、开发高质量、低成本的直投式酸奶发酵剂将保加利亚乳杆菌NQ-2508菌株接种于MRS成为国内乳业的研究热点之一。但由于实验设备液体培养基中在35、36、37、38、39、40℃温度及中试场地的限制，目前此类研究大停留在实验下培养，比较培养到终点时所能达到的活菌数。室研究阶段，未见有进行中试生产研究的相关报1.3.1.4
生长曲线的测定[6]
取真空冷冻干燥保加
导，亦无产业化生产的保加利亚乳杆菌直投式发利亚乳杆菌NQ-2508菌种，接种于正交实验确定酵剂投放市场。
的MRS培养基中，完全溶解后38℃厌氧培养10~本研究是在进行了系统的实验室研究基础上，12h，以4%接种量接入MRS培养基中，38℃厌通过中试规模实验制作保加利亚乳杆菌直投式发氧培养5~8h后，再以4%接种量接入MRS3级培酵剂，并对产品进行稳定性保存实验，以期为产养基中，38℃厌氧培养5~8h后，以5%接种量扩业化生产高效直投式发酵剂提供参考依据。大于MRS发酵培养基中，38℃厌氧培养，分别在1材料与方法0、2、4、5、6、7、8h检测活菌数并测定发酵液pH值，以确定发酵终点的pH值。1.1
菌种
1.3.1.5
冷冻干燥保护剂的确定
将发酵液培养至
保加利亚乳杆菌NQ-2508菌株(Lactobacillus发酵终点时终止发酵，发酵液以8000r/min离心，bulgaricus)：内蒙古轻工科学研究所。弃去上清，将菌泥与不同配比的冷冻干燥保护剂1.2
培养基及主要中试设备
混合均匀后进行真空冷冻干燥获得菌粉。选取蔗MRS培养基[3]：牛肉浸膏20g/L，酵母提取物糖、L-半胱氨酸、海藻糖、谷氨酸钠作为冷冻干5.0g/L，酪蛋白胨10.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷燥保护剂[7]，通过正交实验筛选最佳配比。酸氢二钾5.0g/L，醋酸钠5.0g/L，柠檬酸二铵2.01.3.2菌粉生产中试工艺确定方法
g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，四水合硫酸锰0.2g/1.3.2.1中试工艺流程采取常规的菌粉生产方L，吐温-800.1%，琼脂粉15.0g/L。
法：发酵菌种→活化→接种→发酵→离心收集菌ScientificSystem1029厌氧培养箱：美国体→加保护剂→分装→冷冻干燥至水分含量5％以FORMA公司；GUJS-15全自动控制发酵实验系下→粉碎分装至铝塑袋中密封。
统、GUJS-700L全自动控制发酵系统：镇江东方按上述生产工艺及实验室研究确定的培养基、生物工程公司；、CSA8-06-476连续式离心机：德温度、终点pH值及冷冻干燥保护剂等因素进行3国公司；真空冷冻干燥机：美国Virtis公司。批保加利亚乳杆菌菌粉生产中试。1.3实验方法
1.3.2.2中试菌粉保存稳定性的研究[8]
将中试获
1.3.1
实验室研究方法得的菌粉分别置于-18、4、25℃条件下保存，分1.3.1.1活菌数计数方法[4]用PBS液体将被检样别于0、3、6、9、12个月进行活菌数测定，计算
品10g或10mL按10倍系列稀释至适宜稀释度，保存存活率，以确定菌粉最佳保存条件。选取3级稀释度各吸取1mL注入灭菌平皿中，倒入冷却至45℃的MRS琼脂培养基，待凝固后翻转2结果与分析平皿，厌氧条件下38℃培养48h计数。
2.1
发酵培养基的筛选
1.3.1.2培养基的筛选10%脱脂乳和MRS培养发酵培养基正交实验设计表及实验结果详见基都是适宜于保加利亚乳杆菌生长的培养基，但表1、表2。
10%脱脂乳在工业化生产时不易离心且设备难清表1发酵培养基物质筛选L9(34)正交实验设计表洗，因此本实验选用MRS液体培养基。
采用正交实验方法，对MRS培养基的主要组水
因素平葡萄糖/%A酪蛋白胨/%B牛肉浸膏/%C酵母粉/%D成物质葡萄糖、酪蛋白胨、牛肉浸膏及酵母粉等110．50．50．25进行配比实验，以确定实验培养基的最佳组合[5]。21．5110．51.3.1.3
最适生长温度的研究
《伯杰氏系统细菌
3
2
1．5
1．5
0．75
·15
·
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表2发酵培养基正交实验结果表
实验号123456789均值1均值2均值3极差
因素
A1112223339．4679．90011．4001．933
B[1**********]．06711．0339．6671．366
C1232313129．80010．76710．2000．967
D1233122319．43311．6009．7332．167
结果/(×108cfu/mL)8．0012．108．339．709．8710．2012．5011．2010．50
终点，即确定发酵终点pH为4.70~4.80。2.4
冷冻干燥保护剂的筛选
冷冻干燥保护剂正交实验设计表及实验结果详见表3、表4。
表3冷冻干燥保护剂正交实验L9(34)设计表
因素水
平海藻糖/%A蔗糖/%BL-半胱氨酸/%C谷氨酸钠/%D123
51015
81012
0．511．5
0．511．5
表4冷冻干燥保护剂正交实验结果表
实验号123456789
因素
A111222333
B123123123
C123231312
D123312231
结果(×108
cfu/g)[***********]473333377
实验结果表明：发酵培养基MRS中主要物质最佳组合为葡萄糖2%+酪蛋白胨1%+牛肉浸膏1%+酵母粉0.5%，这几种主要物质对保加利亚乳杆菌NQ-2508菌株生长影响的重要性排序为酵母粉＞葡萄糖＞酪蛋白胨＞牛肉浸膏。2.2
最适培养温度的选择
活菌数/(×108cfu/mL)
121086420
35
36
37
38
39
40
发酵温度/℃
均值1384．000均值2409．667均值3393．000极差
25．667
448．333359．000360．333376．333446．333436．000362．000381．333390．33386．333
87．333
75．667
图1最适培养温度选择实验结果图
实验结果表明：冷冻干燥保护剂最佳组合为海藻糖10%+蔗糖8%+L-半胱氨酸1%+谷氨酸钠1%，其重要性排序为L-半胱氨酸＞蔗糖＞谷氨酸钠＞海藻糖。2.5
中试菌粉生产
由图1可知：随着发酵温度的升高，活菌数也随之增加，当温度升为37℃时，活菌数达到最大值10.66×10cfu/mL；当温度继续升高，活菌数开始下降。因此，确定发酵的最佳温度为37℃。
8
中试菌粉生产共进行3批，结果见表5。
表5中试菌粉生产结果表
批次第1批第2批第3批平均
发酵液活菌数/(×108cfu/mL)
7．537．407．677．53
菌粉活菌数/(×1010cfu/g)
5．175．005．275．15
冻干存活率/
%
91．0392．5090．9691．50
2.3发酵生长曲线测定
由图2可以看出：保加利亚乳杆菌的生长曲线在7h时到达稳定期，此时其活菌数为7.47×108cfu/mL，培养基的酸度值为4.74。
活菌数/(×108cfu/mL)86420
酸度值（pH）
活菌数
酸度
876543
实验结果表明：发酵液活菌数及菌粉活菌数无大幅度变化，中试生产工艺稳定，其冻干存在率平均可达91.50%。2.6
中试菌粉保存稳定性
[1**********]
生长时间/h
图2发酵生长曲线
根据生长曲线图，选择对数生产末期为发酵
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实验结果表明：在-18℃条件下保存的保加利
亚乳杆菌菌粉12个月时其平均存活率为89.37%；
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100发酵工艺参数，并在此基础上进行了菌粉中试生80产实验，最终获得的菌粉活菌数达到了高于5.00×％
／率601010cfu/g的国际先进水平。本研究为酸奶直投式渣-18存402~8℃25℃
℃发酵剂实现产业化生产打下了坚实的基础。
20参考文献：
[1]杨洁彬.乳酸菌-生物学基础及应用[M].北京:中国轻工业
0个月
3个月
6个月9个月
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讨论
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能使酸奶的发酵速度提高，从而防止杂菌污染等[9]张兰威.乳酸菌优良菌株选育及直投式酸奶发酵剂的研
问题出现。若要解决菌粉活菌数低的问题，其重制[D].哈尔滨:东北学业大学博士论文,2002:43-53点在于培养基的组成、发酵工艺的选择及冷冻干[10]
SunhooonK,Ik-KeunY,WooGL,etal.Highratecon－燥剂的选择等方面[9-10]。本研究针对保加利亚乳杆tinuousproductionoflacticacidbyLactobacillusRham－菌NQ-2508菌株通过系统的实验室研究，获得了
nosusinatow-stagemembranecell-recyclebioreactor[J].BiotechnologyandBioengineering,2001,73(1):25-34
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成都生物所发明判断大豆异黄酮糖苷水解的方法
由中科院成都生物所发明的“一种判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解程度的方法”近日获得国家发明专利授权。该发明方法可以检测出以大豆豆饼或豆粕为原料制备的大豆功能性食品或保健品的前处理过程是否使生物活性物质———大豆异黄酮苷元的含量增加了。
大豆异黄酮是大豆等豆科植物生长过程中形成的一类次生代谢产物，具有多种生理功能。它不仅参与调节植物的生长活动，还能对人体发挥有益的生理调节作用。天然大豆异黄酮苷类的分子结构并不是活性发挥的最佳状态，普遍认为苷元才是活性发挥的最佳状态。然而，在大豆中，大豆异黄酮主要是以染料木黄酮、大豆苷和黄豆苷糖苷形式存在的，它们对应的苷元染料木素、大豆苷元和黄豆苷元的含量很少。为了得到生物活性高的大豆异黄酮苷元，在工业上大多以大豆豆饼或豆粕为底物，采用酸水解或微生物转化的方法将糖苷转化为苷元。此前，判断大豆异黄酮糖苷是否水解及水解程度，通常是通过水解前后苷元含量的变化来判断的，此方法过程相对比较繁琐。
成都生物所发明的该种方法，通过商品豆粕经乙醇提取、提取液抽滤除杂质、减压蒸馏浓缩至无乙醇得水相、以水相为底物进行水解、用乙酸乙酯从水解液中萃取大豆异黄酮苷元、萃取液减压浓缩、浓缩相进行薄层层析、在紫外灯下观察层析结果
，以此判断大豆异黄酮糖苷是否水解或水解的程度。该方法具有快速、准确等优点，具有良好的应用前景。
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