纤维蛋白胶对猪深二度烫伤创面愈合的影响

・474・

学研究生学报　　　　　　　　　　Vol. 15　No. 6

　2002年12月　　　　　　　　Dec. 2002Journal of Medical Postgraduates 　　　　　　　　　

・论　　著・

　第15卷　第6期　　　　　　　　　医

纤维蛋白胶对猪深二度烫伤创面愈合的影响

李友良, 　陈玉林, 　郇京宁, 　王广庆, 　王　璐, 　刘　旺

(第二军医大学长海医院烧伤科, 上海200433)

摘要:　目的:探讨外用纤维蛋白胶(FS ) 对猪深二度烫伤创面愈合的影响。　方法:采用猪深二度烫伤模型, 创面

外用FS 。通过伤后不同时相点创面取材, 检测羟脯氨酸(OHP ) 、细胞周期、创面组织含水量、创面愈合时间及组织病理形态学改变, 以1%磺胺嘧啶银霜(Ag 2SD ) 作对照, 观察FS 对猪深二度烫伤创面愈合的影响。　结果:FS 组OHP 含量显著高于Ag 2SD 组; FS 组创面S 期细胞百分比显著高于Ag 2SD 组(P

Ξ

中图分类号:　R644　　　文献标识码:　A 　　　文章编号:　100828199(2002) 0620474204

Researches on wound healing effects of the fibrin sponge in the deep second degree scalded pigs

L I Y ou 2liang , CHEN Yu 2lin ,HUAN Jing 2ning , WAN G Guang 2qing , WAN G Lu , L IU Wang

(Depart ment of B urn , The Second Military Medical U niversity , S hanghai 200433, China )

Abstract :　Objectives :To investigate the effect of Fibrin sponge (FS ) on the deep second degree scalded

wounds of pigs. 　Met hods :The deep second degree scalded wounds of pigs were treated by FS and 1%Ag2SD (control ) ,respectively. The wound healing times ,the content of hydroxyproline (OHP ) ,the water ratio ,the cycle of cells as well as the pathological changing of the wound tissues were examinated at different points post scalded. so as to value the effect of FS on the healing of the deep second degree scalded wounds of pigs. 　Results :Compared with the 1%Ag2SD group , The healing time of the FS group (10. 2±1. 31days ) was shorter than the 1%Ag2SD group (12. 4±1. 14days , P

0　引　　言

面的作用, 本实验设计制作猪深二度烫伤创面模型, 外用FS 后活检测定创面组织OHP 含量、细胞周

纤维蛋白胶(FS ) 是一种生物相容性和降解性较好的物质, 它可以被溶解吸收并促进创面生长, 加快局部组织的生长和修复1。为验证FS 对烧伤创

Ξ

期、创面组织含水量及创面愈合时间, 并进行病理形态学的观察。

收稿日期:　2002204203; 　修订日期:　2002207223

基金项目:　国家重点基础研究发展规划项目(批准号:39870859)

作者简介:　李友良(19642) , 男, 安徽亳州人, 主治医师, 医学博士研究生, 从事组织移植研究, 现在长征医院整形科工作。

1　材料与方法

111　仪器及试剂　流式细胞仪(Beckson dickson Inc. 美国) ,Ultrospec 3000型分光光度仪(Pharmacia Biotech ) ,JA -2003型精确天平(上海天平仪器厂) ,

烤箱过夜。取上述脱水, 脱脂皮肤组织3mg , 加盐酸水解,p H 调至7, 过滤后取1ml 加入样品管, 在空白管及标准管中分别加入蒸馏水及标准液, 各管依次加入柠檬酸缓冲液、氯胺T ,37℃水浴后加过氯酸,5min 后加P 2DMAB ,100℃水浴2min , 冷却后在波长562nm 处比色。

μg/mg 组织) =样品管A /标准管A OHP 含量(

×10×稀释倍数/3

1. 4. 2　细胞周期测定3,5　将全厚皮肤组织剪成皮浆, 加适量D 2Hank 液, 尖吸管吹打,200目筛网过滤,1000r/min 离心5min , 去上清液, 再以400目筛网过滤,70%乙醇固定, 获单细胞悬液。样品细胞数定在1×105/ml , 用流式细胞仪检测6。

取1. 4. 3　烧伤创面组织含水量测定(称重法) 7　

小块创面组织精确称重(湿重) , 置60℃烘箱中烘72h 后再称重(干重) 。

组织含水量(%) =(湿重-干重) /湿重×1001. 4. 4　创面愈合时间　由2名研究人员共同判断。创面达完全上皮化时, 计算创面愈合时间(d ・x s ) 。1. 4. 5　病理学观察　每组动物均分别在不同时相

恒温恒压电烫仪(CB I94I 型上海长海医院研制) ,

FS (上海新兴血液制品研究所) , 氯氨T (上海松江佘山化工厂) , 对2二甲氨基苯甲醛(P 2DMAB 上海试剂三厂) , 过氯酸(上海桃浦化工厂) , 氯仿(上海试剂一厂) , 柠檬酸(上海试剂一厂) , 结晶乙酸钠(上海化学试剂公司) ,PBS 及D 2Hank 液用前配制。1. 2　烧伤创面模型的制备及分组　选20～25kg

中国家养普通白猪3头, 实验前一天背部皮肤去毛。在2. 5%硫喷妥钠静脉麻醉下, 用恒温恒压电烫仪75。C 烫12s , 在实验动物背部制成直径为2. 5cm 圆形深二度烫伤创面(经病理切片证实) 60个(每头动物有20个创面, 每侧10个) 。按外用药不同分FS 组和Ag 2SD 组。烫伤动物分别在伤后1、3、5、7、10、14天在无菌条件下进行创面取材活检, 每个时相点每组各取5个创面。

1. 3　用药方法　FS 的配制与用法:取注射用抑肽酶(1000U/ml ) 和纤维蛋白原(60mg/ml ) 的混合

物, 与凝血酶溶液(每支凝血酶加4ml CaCl 2・2H 2O , 浓度20mmol/ml ) , 在应用于创面时混合, 即成FS 。Ag 2SD 由长海医院药学部提供。FS 和Ag 2SD 分别均匀涂布于无菌纱布上, 厚度为2mm , 然后分别覆盖于创面, 创面全部采用无菌敷料包扎疗法, 每天换药1次, 直至愈合。换药时先以0. 05%醋酸氯己定清创。1. 4　观察指标1. 4. 1　OHP 测定2　将组织块剪碎后加氯仿甲醇液, 研匀过滤后再用乙醇水混合液、丙酮过滤,60。C

点取创面组织标本一块, 大小约1. 5cm ×0. 5cm ,

置入10%甲醛中, 石蜡包埋切片, H 2E 染色, 观察皮肤各层的组织形态学变化。1. 4. 6　统计学处理　实验数据以±s 表示, 进行t 检验处理。2　结　　果

2. 1　烧伤创面OHP 含量的变化　伤后创面的变化

显示,FS 组OHP 含量自伤后3天起均高于Ag 2SD 组, 第5天和第7天尤为明显, 第10天和第14天相差已不明显(表1) 。提示FS 组成纤维细胞增生, 胶原合成增加, 创面愈合加速。

表1　创面OHP 含量的变化(±s , n =5μ, g/mg 组织)

Table 1　Hydroxyproline contents of burn wound (±s , n =5μ, g/mg )

组　别

FS 组

伤　后　时　间　(天)

17. 53±3. 97

347. 67±10. 16

5

95. 37±25. 20

3

7

79. 00±15. 39

310

17. 40±0. 9414

16. 94±0. 99　　　与Ag 2SD 组相比较, 3P

2. 2　创面组织细胞周期的变化

2. 2. 1　创面组织S 期细胞百分比的变化　伤后1、3、5天两组的计算值差异不显著, 无统计学意义。

组增生活跃(表2) 。

2. 2. 2　烧伤创面组织G 0/G 1期细胞百分比的变化

　整个愈合过程中FS 组的G 0/G 1期细胞百分比均低于Ag 2SD 组, 伤后第5天和第7天与Ag 2SD 组比较尤为明显, 提示FS 组细胞已进入活跃的增生阶

伤后第7天FS 组与Ag 2SD 组比较差异明显,FS 组

S 期细胞百分比高于Ag 2SD 组(P

2. 4　烧伤创面组织含水量的变化　实验结果提示,

FS 有明显抑制创面水肿的作用, 在伤后早期(水肿

段, 静止期的细胞比例明显下降(表3) 。2. 3　创面愈合时间　FS 组和Ag 2SD 组平均愈合天数分别为(10. 2±1. 31) 天和(12. 4±1. 14) 天(P

高峰阶段) , FS 减轻水肿的作用尤为明显(P

表2　烧伤创面组织S 期细胞百分比的变化(±s , n =5)

Table 2Percentage of S 2phase in full skin of burn wound (±s , n =5)

组　别

FS 组Ag 2SD 组

伤　后　时　间　(天)

19. 45±3. 979. 51±0. 75

39. 65±0. 8210. 31±1. 12

59. 28±1. 7210. 01±0. 28

711. 67±1. 19

3

1011. 33±1. 3910. 47±1. 01

1410. 78±0. 5410. 64±0. 92

10. 13±0. 28

　　　与Ag 2SD 组相比较, 3P

表3　烧伤创面组织G 0/G 1期细胞百分比的变化(±s , n =5)

Table 2　Percentage of G 0/G 12phase in full skin of burn wound (±s , n =5)

组　别

FS 组Ag SD 伤　后　时　间　(天)

116. 15±1. 5216. 560. 57

314. 35±1. 4215. 261. 44

512. 59±0. 89

14. 461. 61

3

711. 58±1. 31

13. 601. 50

3

1014. 66±0. 6215. 661. 36

1414. 94±1. 7415. 890. 95

　　　与Ag 2SD 组相比较, 3P

表4　烧伤创面组织含水量百分比的变化(±s , n =5)

Table 4　Tissue water percentage of burn wound (±s , n =5)

组　别

FS 组Ag 2SD 组

伤　后　时　间　(天)

1

43. 06±5. 65363. 53±3. 91

353. 96±5. 43362. 06±3. 28

562. 63±6. 8565. 63±1. 70

750. 26±2. 6543. 06±9. 46

1065. 55±4. 7964. 52±1. 16

　　　　　与Ag 2SD 组相比较, 3P

2. 5　病理形态观察　病理切片见伤后第3天组织

生长均不明显, 可见大量组织变性坏死, 胞质浓缩,

胞核固缩, 真皮层可见大量炎性细胞浸润。伤后5天开始生长, 创缘处可见上皮从痂皮下生长, FS 组爬行130mm ,Ag 2SD 组110mm , 新生上皮核大, 染色深。伤后10天细胞生长活跃, FS 组已爬行150mm (图1, 见封三) , 而Ag 2SD 组只有120mm (图2, 见封三) 。FS 组成纤维母细胞生长完全, 密集状, 部分成纤维细胞已成熟。Ag 2SD 组细胞结构较疏松, 成纤维母细胞生长不完全, 尚未纤维化, 提示FS 能促进创面细胞增生和移行, 加速创面愈合。3　讨　　论

炎症反应、细胞增生和细胞外基质重建是创面愈合的基本过程, 任何影响这些过程的因素都可促进或延缓创面愈合。胶原的沉积和修复是创面愈合的主要表现, 胶原的主要成分是OHP , 其在胶原中所占的比例相当恒定, 测定OHP 含量可反映胶原含量, 是创面愈合研究的主要指标7, 伤后OHP 含量

随创面愈合逐渐降至接近正常9。本实验OHP 检测结果表明, 应用FS 后胶原合成增加, 尤以伤后第5天和第7天最为明显, 其原因可能是直接刺激胶原合成或通过巨噬细胞分泌生长因子促进胶原合成, 确切机制有待进一步明确。

深二度烫伤创面愈合的细胞主要来自毛囊、汗腺和创缘的正常细胞。因此, 除常规观察方法外, 我们还采用烧伤创面活检标本的细胞DNA 周期分析作为判断手段, 以期比较客观地反映FS 对烧伤创面愈合的作用8。烧伤创面修复是皮肤细胞不断地活化增生的过程, 当细胞分裂增生时, 细胞周期中的G 期细胞不断进入S 期, 使S 期细胞数增加, DNA 的合成和含量就增加。DNA 合成后, 再进入细胞周期的G 2+M 期, 本实验采用机械法分离出创面细胞, 采用流式细胞仪分析这些细胞的DNA 周期的变化差异, 数据表明, 经FS 处理的创面, G 1期细胞比例下降、S 期及G 2+M 期细胞比例增加, 说明组织中细胞的增生能力提高。与文献报道相一致1, 其原因可能为FS 产生的FDP 能刺激单核细

胞迁移, 后者转变为巨噬细胞, 且巨噬细胞能分泌大量生长因子, 从而促进细胞分裂繁殖。另外, 作为FS 主要成分的凝血酶还能促进成纤维细胞和内皮细胞分裂。本实验提示FS 应用于猪深二度烫伤创面, 能使创面愈合时间明显缩短。病理切片表明, FS 组的上皮细胞和成纤维细胞较Ag 2SD 组生长活

2

3

4

跃。

本实验研究FS 在创面愈合作用中引用的OHP 测定、细胞周期分析、病理形态观察等诸多客观可靠的检测指标, 均提示FS 具有良好的促进创面愈合的作用, 因而FS 是一种颇有应用前景的创面外用药。

参考文献:

5

6789

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(责任编辑　冯　萱)

(上接第473页) 3　讨　　论

G8。Forsoid 8也指出, 核酶由13个保守核苷酸残

基和3个螺旋区组成。因此, 为验证这一理论, 同时

本研究成功地将抗HBV 的核酶及突变核酶构建入带有两侧顺式核酶的体外转录载体中。该质粒经体外转录可释放出目的核酶及突变核酶基因, 去除了核酶两侧的长片段载体序列6。观察了串联的核酶及突变核酶对HBV C 区转录基因的切割作用。结果表明串联的核酶对HBV 基因转录物有剪切作用, 而突变的核酶对靶基因转录物无切割作用, 为核酶抗病毒研究提供了必要的体外研究证据。

核酶自剪切转录载体的设计具有了广泛的应用价值。由于核酶的切割活性与核酶自身的二级结构有关, 同时其两侧的附加序列可影响核酶的切割活性。目前由于常用的核酶载体导入细胞后所产生的核酶, 其两侧的长片段附加序列可阻碍核酶与靶RNA 结合, 同时核酶发挥作用后不能很快与靶RNA 解离, 影响核酶的切割效率。因此, 引入自剪切核酶可去除附加序列的影响, 同时也可将目的核酶限制在细胞核内。根据计算机的设计, 我们合成两个顺式核酶和目的核酶, 并将他们构建入p GEM 2Rz123中, 体外转录证实可以得到自剪切的核酶, 这一实验结果与计算机预测相一致。同时本研究结果也表明, 突变的核酶没有剪切活性。Scott W G 7指出, 最小的核酶结构中至少需要A1521,A9, G5和

也为在细胞内的作用进行研究, 排除反义核酶的影响, 所以将活性必须的A1521突变, 实验结果也证实了上述理论的正确性。为进一步在细胞内研究核酶的作用和为细胞内应用核酶抗病毒感染奠定了基础。抗HBV 核酶细胞内限制HBV 基因表达的作用将另文报道。

参考文献:

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2345

6

78

(责任编辑　李风华)

李友良, 等:纤维蛋白胶对猪深二度烫伤创面愈合的影响(正文见第476页

) 图1　伤后3天FS 组　(H 2E 　4×3. 3)

Figure 1　The 3rd day postburn of FS group 　(H 2E 　4×3. 3

)

图2　伤后3天Ag 2SD 组　(H 2E 　4×3. 3)

Figure 2　The 3rd day postburn of Ag 2SD group 　(H 2E 　4×

3. 3)

陈光辉, 等:雌激素减轻脑缺血2再灌注损伤的可能机制探讨　(正文见第489页

)

图1　OVX 组缺血2h 再灌注70h 脑组织切片

Figure 1　Brain section followed by 22hour ischemia and 702

hour reperfuson in the OVX group

　　

缺血半球海马神经元, 有深棕色沉积为阳性细胞, 可见凋亡小体, 有明显细胞脱失(TUN EL ×200

)

图2　OVX +E 2组缺血2h 再灌注70h 脑组织切片

Figure 2　Brain section followed by 22hour ischemia and 702

hour reperfusion in the OVX group

　　

缺血半球海马神经元, 阳性细胞数和细胞脱失均少于OVX 组(TUN EL ×200)

张丽京, 等:人眼结膜吸吮线虫病1例报告(正文见第564页

)

图1　结膜吸吮线虫位于上睑结膜囊