乳酸杆菌表达系统的研究进展

乳酸杆菌表达系统的研究进展

丁 轲 程安春

(四川农业大学动物科技学院 四川雅安 625014)

乳酸杆菌是一种常见的益生菌，它的应用已有几百年的历史，是一种公认的具有GRAS(Generally Regarded As Safe)有益微生物。该菌广泛存在于人、动物和植物中，可以产生多种物质，如短链脂肪酸、过氧化氢、细菌素、蛋白质和各种酶类等。尤其重要的是它是人和动物肠道中最重要的优势菌群之一，对于机体的代谢、免疫调节等方面起着极其重要的作用。但随着基因工程技术的发展日趋完善，人们已不再满足于乳酸杆菌自身固有的功能，特别是当前由于疫苗免疫和菌(毒)株的残留毒力之间的矛盾，促使人们寻求能良好表达外源抗原且安全的疫苗载体候选菌株，乳酸杆菌便自然成为最佳选择菌株之一，因此近年来在疫苗载体的研究中日益受到重视，但其研究却远远落后于病原微生物。现就这一方面作一综述。

1 乳酸杆菌表达载体的优点

乳酸杆菌作为表达载体有许多独特的优势，这主要是因为乳酸杆菌是人和动物体内最优势的益生菌株之一，许多研究都表明它的有无和多寡都对机体有着至关重要的影响，以它为表达系统有其它菌株不可比拟的优点，主要表现在以下方面：①乳酸杆菌是至今发现的唯一没有致病性的一个种；②它在人和动物体内占绝对优势，以它为表达系统，较其它菌株更易达到较高的表达量；③若选择非抗性标记，则该表达系统中的菌体、选择性标记、诱导物均为食品级，为生产绿色安全的食品提供了可能；④乳酸杆菌菌体本身就对机体有益生作用，其分泌多种物质更是机体必不可少的，若再在其载体上克隆入外源基因，这样就可集菌体、自泌物质和外源蛋白于一体；⑤乳酸杆菌对机体粘膜有极强的粘附作用，因此构建的乳酸杆菌基因工程菌就可在粘膜处不断繁殖，持续向机体释放目的蛋白；⑥乳酸杆菌可直接口服，能够耐受胃液中的强酸和小肠上段的胆盐，这样就免去了目的蛋白的体外提纯等后加工。

2 乳酸杆菌质粒

1976年Chassy[1]首先发现乳酸杆菌中存在质粒，质粒在不同的乳酸杆菌中分布不均，Vescovo等[2]对159株乳酸杆菌进行质粒抽提，发现L. reuteri、L. helveticus 和L. acidophilus含质粒的比率较高，分别为63%、27%和20%，L. casei仅有4%的菌株含有质粒，L.plantarum、L. brevis 和L. coryniformis没有发现质粒。Mckay等[3]研究表明约有38%的乳酸杆菌中含有质粒，大小约在1.2kb~150kb之间，且数量各异。经研究表明乳酸杆菌质粒具有如下特点：

(1)大多数乳酸杆菌质粒均为隐蔽型质粒，但现已证明某些乳酸杆菌的细菌素、与糖代谢有关的酶及抗生素抗性等都是由不同质粒所决定[4-5]，现已由来自乳酸杆菌隐蔽型质粒构建了许多携带乳酸杆菌复制子的质粒载体；(2)乳酸杆菌质粒具有分离稳定的特点；(3)乳酸杆菌中较小的质粒拷贝数高，一般可达30~50个。（4）很多乳酸杆菌质粒的复制子具有广泛宿主范围，可在不同种类的菌株之间同时进行复制，这就避免了专一性质粒在菌株之间使用时不要进行的亚克隆，如pW425e就可同时在乳酸杆菌和大肠杆菌中表达。(5)不同来源的乳酸杆菌质粒具有差异性，研究表明来自鸡、猪、小鼠等动物肠道中乳酸杆菌，质粒阳性菌株较少，而来源于橄榄的乳酸杆菌中均发现有不同大小的质粒存在；(6)乳酸菌属的某些菌株(如乳酸乳球菌)的质粒也可作为乳酸杆菌的质粒，如由具有广泛宿主范围的载体乳酸乳球菌质

粒pGK12构建出许多的乳酸杆菌基因转化系统；(7)一些乳酸杆菌质粒没有宿主特异性，如pIP501、pKP825和pLPE323适用于广泛宿主范围，因而它们可在许多不同种类乳酸杆菌中进行增殖，而且它们在不同种类乳酸杆菌中的扩增拷贝数并没有明显不同，这说明其在不同宿主菌中的DNA复制调控机制是相似的。现已有多种乳酸杆菌质粒被提出并鉴定，如表1所示。

3 乳酸杆菌质粒基因表达调控

由于乳酸杆菌的质粒大多是隐蔽型的，因此对乳酸杆菌基因转录和翻译的调控及蛋白质分泌的机制还不甚了解，这可能也是乳酸杆菌分子生物学研究滞后的原因。但随着基因工程技术的发展，已分离出了乳酸杆菌的各种表达调控元件，通过对部分质粒DNA序列的测定，然后再同已知序列的质粒的基因进行比较来推测未知质粒部分基因的功能，相继开发出了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体、整合载体。经过研究发现乳酸杆菌质粒基因中普遍存在两种调控序列，一种是与基因复制起始相关的序列，主要包括两大类：一类是编码蛋白的开放阅读框架ORF，是复制相关蛋白的核酸序列，在乳酸杆菌中这些与质粒复制相关的ORF之间存在同源性，同时这些序列与革兰氏阳性菌的质粒也有显著的同源性[6]。另一类是与调控有关的非编码序列，主要包括复制相关蛋白作用的靶序列、正、负向复制起始点、缺失位点、启动子等复制区元件；另一种是控制质粒拷贝数和不相容性的DNA序列[7]。质粒的拷贝数是由DNA非编码序列中的重复序列和反转录RNA来控制的。Baets[8]和Pridmore[9]都在质粒中发现了多个这样的重复序列。Pouwels[7]在质粒p353-2中发现有两个反转录RNA，它们在rep5’非翻译区以反方向转录，通过衰减rep基因转录来控制质粒的拷贝数。另外，乳酸杆菌中小于5.0kb的质粒多以滚环方式进行复制，因此具有滚环复制所必需的复制启动元件，这些结构包括正、负复制起始点、复制控制元件和移动元件等。这些序列或元件与其它源于革兰氏阳性菌的质粒的相应区域的广泛的同源性，推测乳酸杆菌质粒的这些序列或元件是通过基因内或基因间传递机制而获得的。

Plasmid

pLPC37

pLP825

pLE16

pLHR

pLP317

pLP317cop

pLPE323

P:PE350

pLEP24Mcom

pLP82H

pULP8/9

pLUL634

pLP353xyl

pW425t

pBG10 表1 部分乳酸杆菌质粒特点 Origin Size(kb) L.plantarum 3.7 L.plantarum 5.8 L.bulgaricus 7.6 L. helveticus 8.5 L.pentosus 2.9 L.pentosus 2.9 L.pentosus 3.6 L.pentosus 3.9 L.pentosus 3.7 L.plantarum 5.8 L.plantarum 6.6 L.reuteri 5.1 L.pentosus 6.3 L.casei 3.7 L.helveticus 6.0 Mark Cml Cml Cml Ery Ery Ery Ery Ery Ery Ery Ery Ery Syl.ery thyA lacZ

3 乳酸杆菌质粒的选择性标记

目前乳酸杆菌的质粒的选择性标记大多为红霉素(ery)、氯霉素(chl)等抗生素抗性标记，如pLP82H、pLP317、pLE16等，但食品级乳酸杆菌表达系统才是该领域研究的前沿和热点，为了开发适用于人和动物的食品级乳酸杆菌表达载体，研究者寻求构建非抗生素标记的质粒载体，这些标记基因均来源于乳酸杆菌或在食品中有长期安全使用史的细菌。现在用于乳酸杆菌表达系统的食品级选择性标记主要有三类：糖类利用标记(D-木糖基因[10])、营养缺陷型标记(β-半糖苷酶基因[11]、ThyA基因[12]等)、编码细菌素抗性[13]和荧光蛋白标记[14]。这样构建出的乳酸杆菌表达系统中，载体、受体及诱导物均为食品级，可直接制成口服制剂免去一般基因工程菌所需的繁琐、复杂的后提取工艺，为生产安全、廉价的生物制品开辟新途径，所以，食品级的乳酸杆菌工程菌可直接应用于食品工业和医药保健等领域，有其巨大的应用前景和潜在的商业价值。

利用这些标记主要有两种方法，一是某种糖或营养仅为少数乳酸杆菌利用，而别的乳酸杆菌不能利用其为发酵底物，就可将能发酵这种物质的乳酸杆菌的这段基因克隆并表达在乳酸杆菌的质粒载体上，转化入不能利用这种物质的乳酸杆菌中进行表达，这样就可通过该物质作为底物来筛选。例如除L.brevis 和L.pentosus外，其余乳酸杆菌均不能利用D-木糖作为碳源，Posno [10]和Stéphane等 [15]乳酸杆菌染色体上的xyl基因克隆到相应的质粒载体上，再将其转入不能利用木糖的干酪乳杆菌中，结果转化子获得了可利用木糖的能力，由此得到了利用木糖发酵作为乳酸菌中食品级选择标记。另一种方法是通过诱变使宿主菌失去利用某种物质的功能，然后再将编码该底物的基因克隆在乳酸杆菌的质粒上，转化入突变菌株，以此为选择标记来进行筛选。王春凤等[16]通过体外诱变使乳酸杆菌的胸苷酸激酶(ThyA)基因缺失，然后再将干酪乳杆菌ATCC1.115染色体上的ThyA基因克隆在质粒pW425e上，这样就可以ThyA基因为选择性标记。

lafI 基因是约氏乳杆菌VP111088产生的Lactacin F的免疫基因，Kanatani 等[17将含有lafI基因的质粒pTRK434 转化到发酵乳杆菌NCDO1750后，可用加入Lactacin F的培养基选择转化子，并且lafI 标记片段小，通用性好，可在许多对Lactacin F 敏感的乳杆菌中使用。此外，嗜酸乳杆菌Acidocin A[18]和Acidocin B[19]的结构基因和免疫基因已分别在干酪乳杆菌与植物乳杆菌和发酵乳杆菌中表达，这都给利用细菌素免疫基因作为食品级标记提供了可能。此外作为食品级诱导信号还有温度[20-21]、盐[22]、pH、和噬菌体感染等。

4 乳酸杆菌基因工程的应用

目前由于人们对大肠杆菌的遗传背景比较清楚，因此大多采用它来作为外源基因的表达系统，但大肠杆菌是潜在的致病菌，且易形成包涵体，不利于外源蛋白的分离和纯化。而乳酸杆菌是GRAS菌，虽然有几百年的应用历史，但其遗传背景却不太清楚。乳酸杆菌作为外源蛋白的表达载体的最大优点是其可以通过口服，也就是说可以同食物或水一同食用，不仅对机体无毒无害，而且乳酸杆菌自身及其各种代谢产物对机体也有营养和免疫功能，再加上其携带的目的蛋白的专一性作用，可以说是集多种功能于一体，这就是目前在微生态学领域中提出的多功能微生态制剂，因此乳酸杆菌食品级载体的研究与开发具有相当潜力和意义。 由于乳酸杆菌本身就是源于发酵业的应用而著称，如酸奶、米酒、泡菜等。若使其携带外源目的基因，则可在发酵产物中表达更多的目的产物，从而使发酵产物更符合人们的需要。例如使乳酸杆菌携带赖氨酸、蛋氨酸等基因，通过直接饲喂乳酸杆菌可减少向饲料中添加这些物质，从而可降低饲料成本。Hashiba[23]将Bacillus.Licheniformis的α-淀粉酶结构基因插入pBG10的红霉素抗性基因启动子区下游，在L.helveticus SBT2195中获得成功表达。

Pouwels等[17]也成功地构建了携带乳酸杆菌L-1dh基因强启动子和Lactoamylovorus淀粉酶基因的调节启动子的表达和分泌载体。

乳酸杆菌是一种良好的疫苗载体，用乳酸杆菌作为疫苗载体不仅可使口服的乳酸杆菌刺激产生粘膜及全身免疫反应，提高某些免疫活性因子如IL-2、INF、TNF-α的分泌，而且可将特异性抗原分子携带并分泌到肠道，同时也可穿过肠壁进入粘膜下层，进而引起细胞免疫和体液免疫，因此它是一种极有前景的疫苗载体。在“全球健康重大挑战”计划中的“新希尔伯难题”中即有一项“为改进儿童疫苗，开发有效的单剂疫苗，使婴儿出生后不久即可服用，发展不需要注射的疫苗接种系统”，这项计划向我们展示了未来疫苗开发的重点可能是口服疫苗，力图通过口服免疫以减轻接种者的痛苦，因此乳酸杆菌表达系统的研制成功可能会引起一场免疫学界的革命。自从乳酸杆菌的质粒发现以来，研究者[24]就试图在乳酸杆菌中表达异源抗原，广泛展开了将乳酸杆菌作为活菌疫苗载体的研究。Zegers等[25]和Maassen等[26]利用乳酸杆菌作为疫苗载体，携带表达外源抗原，通过粘膜免疫动物，可诱发抗感染免疫。Pouwels等[27]则构建了乳杆菌的一系列表达载体，用于表达破伤风毒素C片段、幽门螺杆菌脲酶A和B亚单位等抗原。他还用pLPCR2载体表达两个并列重复口蹄疫病毒和大肠杆菌β-半糖苷酶基因的融合蛋白，在干酷乳杆菌中融合蛋白的表达大约为细胞总蛋白的0.1%。实验发现，外源抗原基因表达于细胞内或细胞表面，均能诱发针对该抗原的全身和局部粘膜免疫反应；通过口服、鼻粘膜或腹腔注射等途径接种，也均可引起有效的免疫应答。Corinne[28]用一株人源乳酸杆菌L.plantarum(NCIMB8826)作为表达宿主，根据质粒的构建可以在细胞质中获得不同水平的47kDa的破伤风毒素C片段(TTFC)，所有重组的菌株通过小鼠鼻腔免疫均证明有免疫原性并能极大提高系统中的IgG(IgG1、IgG2b、IgG2a)反应，并且这些反应与抗原的剂量有关，抗破伤风毒素的保护只能通过产最高剂量的抗原的活菌获得，气管中特异的TTFC粘膜IgA和颈淋巴结中的抗原特异性T细胞显著提高，在以双倍剂量免疫的小鼠中这两种指标会更高。更有意义的是，法国和巴西已于2000年联手开展在乳酸杆菌中表达轮状病毒的抗原基因，然后用重组的乳酸杆菌发酵生产酸奶，来预防儿童轮状病毒性腹泻。近年来国内也相继开展了这方面的工作，何召庆等[29]将鲑降钙素基因克隆并表达在乳酸杆菌质粒pW425t中，然后转化到ThyA基因缺陷的乳酸杆菌中表达。王春凤等[30-31]在质粒pW425t中成功地表达了鸡球虫SO7基因，将该重组的乳酸杆菌给刚出壳的雏鸡饲喂，一周后攻球虫卵囊5×105个/只，通过测定试验雏鸡的体重未发生变化表明了基因工程乳酸杆菌的有效性。王红梅等[32]用乳酸杆菌表达人绒毛膜促性腺激素β亚单位(hCGβ)，经阴道粘膜免疫小鼠2周后，小鼠阴道洗液中可检测到hCGβ(P

随着基因工程技术的发展，重组的乳酸杆菌基因工程菌的时代将要到来，并将在未来食品和医药工业中得到更广泛的应用。但目前用乳酸杆菌表达外源基因还存在着这样或那样的缺陷，如对乳酸杆菌表达调控的机制还不太清楚，直接饲喂重组的乳酸杆菌并不能在体内表达足够的抗原量，长期低剂量的刺激可能导致机体免疫耐受，口服重组乳酸杆菌可能只对局部病变有较好的预防效果等。但随着研究水平的提高，通过对乳酸杆菌进一步改造、表达调控的认识不断深入和对免疫学特别是粘膜免疫机制的研究，我们将会得到更为优良的益生乳酸杆菌基因工程菌。

参考文献

1. Chassy B M, Gibson E, Giuffrida A. Evidence for extrachromosomal elements in Lactobacillus [casei]. J

Bacteriology. 1976, 127(3): 1576~1578.

2.Vescovo M, Bottazzi V, Sarra P G. Evidence of plasmid deoxyribonucleic acid in Lactobacillus. Microbiologica. 1981, 4(4): 413~419.

3.Mckay L L, Baldw in K A. Applications for biotechnology: present and future in provements in lactic acid bacteria. FCMS Microbiol Rev, 1990:87(1-2):3~4.

4.Smiley M B, Fryder V. Plasmids, lactic acid production, and N-acetyl-D-glucosamine fermentation in Lactobacillus helveticus subsp. jugurti. Appl. Environ. Microbiol.1978, 35(4): 777~781.

5.Fortina M G, Parini C, Rossi P. et al. Mapping of three plasmids from Lactobacillus helveticus ATCC 15009. Letters in Applied Microbiology. 1993, 17(6):303~306.

6.Fortina M G, Parini C, Rossi P. et al. Mapping of three plasmids from Lactobacillus Helveticus ATCC15009. Lett App Microbiol, 1993,175(19):6341~6344.

7.Pouwels P H. Control of replication of the Lactobacillus pentosus plasmid p535-2:evidence for a mechanism involving transcriptional attenuation of the gene coding for the replication protein. Mol Gen Genet. 1994,242(5):614~622.

8.Baets EE. Characterization of a cryptic plasmid from Lactobacillus plantarum. Gene, 1989,85(1):253~258.

9.Pridmore D. Crytic plasmids from Lactobacillus helveticus and their evolutionary relationship. FEMS Microbiol Lett, 1994,124(3):301~305.

10.Posno, M., Heuvelmans P T, van Giezen M J, et al. Complementation of the inability of Lactobacillus strains to utilize D-xylose with D-xylose catabolism-encoding genes of Lactobacillus pentosus. Appl. Environ. Microbiol. 1991,57:2764-2766.

11.王春凤，孙哲，汪明.鸡消化道β-半糖苷酶基因缺陷型共生乳酸菌的筛选.中国预防兽医学报，2003，25(6)：408~411.

12.Hashiba H. Establishment of a host-vector system in Lactobacillus helveticus with β-galactosedase activity as a selection marker. Biosci Biotechnol Biochem, 1992,50:190~194.

13.Takala T M, Saris P E J. A food-grade cloning vector for lactic acid bacteria based on the nisin immunity gene nisI. Applied-Microbiology-and-Biotechnology. 2002, 59: 4-5, 467-471.

14.Perez A I, Perez M G. Optimization of the green fluorescent protein (GFP) expression from a lactose-inducible promoter in Lactobacillus casei. FEMS-Microbiology-Letters. 2003, 222(1): 123-127.

15.Stéphane C, Yeou-Cherng B, Carl A, et al. Molecular cloning and functional expression in Lactobacillus plantarum80 of xylT, encoding the D-xylose-H+ symporter of Lactobacillus brevis. Applied Environ Microbiol, 1998, 64(12): 4720~4728.

16.王春凤，秦泽荣，孙哲，等. 以胸苷酸合成酶为选择压力的穿梭质粒载体的构建.微生物学通报，2001，28(1)：42~46.

17.Kanatani K, Oshimura M, Sano K. Isolation and characterization of acidocin A and cloning of the bacteriocin gene from Lactobacillus acidophilus. Appl Environ Microbiol, 1995, 61:1061~1067.

18.Pouwels P H, Leer R J, Boersma W J A. The potential of Lactobacillus as a carrier for oral immunization,development and preliminary characterization of vector system for targeted delivery of antigens. J Biotechnol, 1996,44(1~3):183~192.

19.Medina E, Guzman C A. Use of live bacterial vaccine vectors for antigen delivery:potential and limitations. Vaccine, 2001,19(13~14):1573~1580.

20.Serror P, Ilami G, Chouayekh H, et al. Transposition in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus: identification of two thermosensitive replicons and two functional insertion sequences. Microbiology Reading. 2003, 149(6):1503~1511.

21.Neu-T， Henrich-B. New thermosensitive delivery vector and its use to enable nisin-controlled gene expression in Lactobacillus gasseri. Appl Environ Microbiol. 2003, 69(3):377~1382.

22.Nakamura S, Miyamoto T, Izumimoto M. Isolation and characterization of citrate metabolism-deficient mutants

in Lactobacillus plantarum IFO 3070. Animal Science and Technology. 1991, 62(12):1142~1148.

23.Hashiba H. Establishment of a host-vector system in Lactobacillus helveticus with β-galactosedase activity as a selection marker. Biosci Biotechnol Biochem, 1992,50:190~194.

24.Medina E, Guzman C A. Use of live bacterial vaccine vectors for antigen delivery: potential and limitations. Vaccine, 2001,19(13~14):1573~1580.

25.Zegers N D, Kluter E, Van der stap H, et al. Expression of the protective antigen of bacillus antracis by Lactobacillus Casei: towards the development of an oral vaccine against anthrax. J Appl Microbiol, 1999,87:309~314.

26.Maassen C B M, Laman J D, Heijine M J, et al. Instruments for oral disease-intervention strategies: recombinant Lactobacillus Casei expressing tetanus toxin fragment C for vaccination or myelin proteins for oral tolerance induction in multiple sclerosis. Vaccine, 1999: 2117~2128.

27.Pouwels P H, Leer R J, Shaw M. Lactic acid bacteria as antigen delivery vehicles for oral immunization purposes. Int J food Microbiol, 1998,41(2):155~167.

28.Corinne G, Heide M, Denise G, et al. Mucosal Immune Responses and Protection against Tetanus Toxin after Intranasal Immunization with Recombinant Lactobacillus plantarum. Infection and Immunity, 2001, 69(30):1547~1553.

29.何召庆，秦泽荣，徐镔蕊，等.降钙素基因在乳酸杆菌中的克隆.中国兽药杂志，2002，36(6)：20~22.

30.王春凤，秦泽荣，孙哲，等.柔嫩艾美尔球虫SO7基因在乳酸杆菌中的表达.自然科学进展.

31.王春凤，秦泽荣，徐镔蕊，等. 饲喂转球虫基因功能乳酸杆菌后对雏鸡体重的影响. 畜牧兽医学报，2002，33(6)：591~593.

32.王红梅，李大金，袁敏敏，等.表达hCGβ的乳酸杆菌经阴道粘膜免疫的研究.中国免疫学杂志，2003，19(10)：701~703.