蝙蝠蛾拟青霉高产腺苷液体培养基优化_张倩

蝙蝠蛾拟青霉高产腺苷液体培养基优化

张 倩 吴海亮 于士军

（安徽农业大学微生物防治省重点实验室，安徽合肥230036）

摘 要：为了提高蝙蝠蛾拟青霉菌株RCEF0936腺苷的代谢量，以腺苷含量为指标，采用高效液相色谱法（HPLC），在

单因子试验的基础上通过正交试验对其高产腺苷的液体培养基进行优化研究。结果表明，在培养温度25℃、摇床转速140rpm/min、摇瓶装液量100ml/250ml、接种量5%、培养时间6d的条件下，蝙蝠蛾拟青霉菌株RCEF0936的高产腺苷的最佳液体培养基配方为：葡萄糖2%，酵母浸出粉2%，硫酸锰0.05%，硫酸锌0.05%；试验中选择的4种因子对蝙蝠蛾拟青霉菌株RCEF0936菌丝体中腺苷含量的影响由大到小依次是硫酸锌>酵母浸出粉>硫酸锰>葡萄糖，且均达到极显著水平（P

中图分类号Q939.1;S567.35　 文献标识码A 文章编号1007-7731（2010）24-025-004

Optimization of Liquid Culture Medium for Adenosine Production of Paecilomyces hepiali

Zhang Qian et al.

（Key Laboratory of Microbial Control of Anhui, Anhui Agricultural University, Hefei230036, China）

In order to enhance the yield of adenosine of Paecilomyces hepiali, namely RCEF0936, the liquid culture Abstract：

medium was optimized through orthogonal experiment based on single factorial experiments. The content of adenosine

in RCEF0936 was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. The results showed that the optimized medium components were glucose 2%, yeast 2%, MnSO4・H2O 0.05%, ZnSO4 0.05% under the conditions of culture temperature 25℃, shake rotation 140 rpm/min, culture medium amount 100ml/250ml（V/V）, inoculum 5%（V/V）, fermentation perio 6 days. The effects of four factors, mentioned above, on the contents of adenosine in RCEF0936 all significant（P yeast > MnSO4・H2O > glucose. The contents of adenosine of RCEF0936 could reach 2.85 mg/g in the optimized liquid culture medium and increase 390% compared with the not optimized the culture medium. Through t-test statistical analysis, we could know the difference was significant （P

Paecilomyces hepiali;Adenosine; Culture medium; OptimizeKey words：

冬虫夏草Cordyceps inensis（Berk.）Sacc. 简称虫草（CS），是由真菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾幼虫上而形成的虫菌复合体，系名贵中药材，具有补虚损、滋精气、补肺益肾等功效[1]。从冬虫夏草中分离出的蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali Chen et Dai），经人工发酵培养，获得发酵虫草菌丝体。据报道，蝙蝠蛾拟青霉与天然冬虫夏

3]

草的主要成分、药理作用基本相似[2，。腺苷是虫草类产品

5]

的影响[4，。本试验对蝙蝠蛾拟青霉RCEF0936菌株的高产

腺苷的液体培养基进行了研究，以菌丝体中腺苷含量为指标，采用高效液相色谱法为检测手段，通过正交试验对其高产腺苷的液体培养基进行优化，采用DPS分析软件对试验结果进行分析，以期得到蝙蝠蛾拟青霉菌株RCEF0936

7]高产腺苷最佳液体培养基配方[6，。

1 材料与方法

1.1 供试材料

（Paecilomyces hepiali）菌株1.1.1 菌株 蝙蝠蛾拟青霉

RCEF0936，由安徽省微生物防治重点实验室提供。 斜面种子培养基（%）：蛋白胨1、葡萄糖1.1.2 培养基 （1）

4、酵母粉1、琼脂2、pH自然；（2）优化前培养基（%）：蛋白胨1、葡萄糖4、酵母粉1、pH自然；（3）微量营养因子优化基础

的主要活性成分，目前出售的发酵虫草菌丝粉等保健品的核苷类成分也主要为腺苷。

姜文侠等对蝙蝠蛾拟青霉的发酵条件进行了研究，并对其主要成分进行检测和分析，得到腺苷含量为0.24%，虽然达到了药典中规定的要求，但结果属于偏低水平，其试验中也未体现培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中腺苷含量

张 倩（1985-），女，山东金乡人，在读硕士，研究方向：微生物与生物制药。 收稿日期：2010-11-16作者简介：

培养基（%）：蛋白胨1、葡萄糖4、酵母粉1、pH自然；（4）碳源优化基础培养基（%）：蛋白胨1、酵母粉1、硫酸镁0.5、硫酸锌0.5、pH自然；（5）氮源优化基础培养基（%）：葡萄糖4、硫酸镁0.5、硫酸锌0.5、pH自然。

由上海化学试剂公司进口分装；1.1.3 试剂 腺苷标准品，

乙醇、四氢呋喃、磷酸氢二钠等国产分析纯试剂；检测用水为三重蒸馏水。

（苏净集团安泰公司1.1.4 设备和仪器 T144型超净工作台

产品）；LRH-250-G型光照培养箱（广东省医疗器械厂产品）；HZQ-F 160型全温振荡培养箱（哈尔滨东联电子公司产品）等，其余各种玻璃器皿均为实验室常规仪器。检测仪器采用YOUNGLIN高效液相色仪；YOUNGLIN UV730D检测器；泵为YOUNGLIN SP930高压泵；流动相为2％四氢呋喃的磷酸缓冲溶液[0.066mol/L磷酸二氢钾溶液-0.066mol/L磷酸氢二钠溶液（4:6）]，流速为1.0ml/min，UV检测波长260nm，进样量20μl，柱温为室温。1.2 试验方法

121℃灭菌1.2.1 菌种的活化 分装斜面种子培养基，

20min，制成斜面培养基。将保存的菌种接入斜面培养基上，25℃恒温光照培养6d后备用。

1.2.2 液体摇瓶种子制备 已培养好的斜面菌种接入灭菌的摇瓶培养基中，装液量200ml/500ml，置于全温振荡培养箱25℃、140r/min条件下培养5d，作为液体种子备用。硫1.2.3 微量营养因子筛选试验 供试营养因子有甘氨酸、酸亚铁、硫酸锰、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸铝钾、硫酸锌、硫酸镁、复合VB、氯化钠、氯化钙、硫酸铜。将供试营养因子按0.05%的比例分别加入基础培养基。

甘油、麦芽糖、蔗1.2.4 碳源筛选试验 供试碳源有葡萄糖、

糖、麸皮、玉米粉、白砂糖（其中麸皮、玉米粉煮沸20min，2层纱布过滤）。将供试碳源按4%的比例分别加入基础培养基。

黄豆粉、蛋1.2.5 氮源筛选试验 供试氮源有酵母浸出粉、

白胨、酵母粉、豆粕粉、蚕蛹粉（其中黄豆粉、豆粕粉、蚕蛹粉煮沸20min，2层纱布过滤）。将供试氮源按3%的比例分别加入基础培养基，摇瓶装液量为100ml/250ml，按5%接种量分别接种。

1.2.6 培养基组分浓度配比试验 为了探讨培养基中碳源、氮源、微量营养因子等各组分参数相互交叉影响，设计并按L9（34）正交试验表进行试验。

（2005版一部）[8]的方法结合现1.2.7 检测方法 参考药典

有的试验条件利用HPLC进行测定菌丝体中腺苷的含量。将待测样品研磨至细粉状，称取1.0g，置于50ml容量瓶中，用55%稀乙醇定容后称重，33kHz超声波下提取60min，再称重，用稀乙醇补至恒重。摇匀，取上清液10 000rpm/min离心10min，取出上清液作为待测样品经0.22μm微孔滤膜过滤后，用微量进样器吸取20μl进样，外标法测峰面积计算样品中腺苷含量。标准曲线的回归方程：Y=18.844x-13.446，R=0.9 997，线性范围0.01～0.4mg/ml。

2.3 氮源筛选结果

试验中比较分析了6种不同氮源对RCEF0936腺苷产量的影响，结果见图3。由图3可知，

酵母浸出粉试验组中2.2 碳源筛选结果

试验中比较分析了7种不同碳源对RCEF0936菌株腺苷产量的影响，结果见图2。由图2可知，葡萄糖试验组中RCEF0936菌株菌丝体中腺苷含量最高。另外，葡萄糖试验组RCEF0936菌株的生物量也比较高，而从RCEF0936菌株中菌丝体中腺苷总含量来讲，葡萄糖试验组中腺苷总含量最高。因此确定葡萄糖为RCEF0936菌株液体培养的最佳碳源。

2 结果与分析

2.1 微量营养因子筛选结果

试验中比较分析了12种不同微量营养因子对RCEF0936腺苷产量的影响，结果见图1。由图1可知，硫酸锌试验组RCEF0936菌株菌丝体中腺苷含量最高，对照组最低。另外，从RCEF0936菌株的生物量方面来考虑，硫酸锰试验组RCEF0936菌株的生物量最高为1.9 038g/100ml。硫酸锰试验组和硫酸锌试验组中RCEF0936菌株中腺苷总含量显著高于其他试验组，选择硫酸锰和硫酸锌作为RCEF0936菌株液体培养的最佳微量营养因子。

张 倩等 蝙蝠蛾拟青霉高产腺苷液体培养基优化27

RCEF0936菌株菌丝体中腺苷含量最高。另外，酵母浸出粉试验组中RCEF0936菌株的生物量也比较高，略低于酵母粉组和黄豆粉组。酵母浸出粉试验组RCEF0936菌株菌丝体中腺苷含量明显高于其他试验组。因此选择酵母浸出粉作为RCEF0936液体培养的最佳氮源。2.4 培养基成分的确定

为了探讨培养基中碳源、氮源、微量营养因子等各组分参数相互交叉影响，采用DPS统计分析软件设计了一个4因素3水平的正交表L9（34）进行正交试验优化培养基（见表1）。

中4个因素的最佳组合为A3B2C3D3，即以生物量为指标，RCEF0936菌株液体培养的最佳培养基组成为：葡萄糖4%，酵母浸出粉3%，硫酸锰0.1%，硫酸锌0.1%。

从表2、表3可以看出，试验中选择的4个因素对RCEF0936菌株菌丝体中腺苷含量的影响大小依次是D>B>C>A。以菌丝体中腺苷含量为指标时，试验中4个因素的最佳组合为A1B1C2D2，即RCEF0936菌株高产腺苷的最佳培养基组成为：葡萄糖2%，酵母浸出粉2%，硫酸锰0.05%，硫酸锌0.05%。从表4、表5可以看出，试验中选择的4个因素对RCEF0936生物量的影响大小依次是A>B>D>C。试验

分析结果表明，4种因素对生物量和菌丝体中腺苷含量的影响明显不同。由于B因素的水平1和水平2之间以及D因素的水平2和水平3之间对RCEF0936腺苷产量的影响无显著性差别，

(下转70页)

2.2 加强队伍建设，增强承试人员的社会责任感

水稻区试工作是水稻新品种选育和推广的重要基础工作，它为国家和各省品种审定、推广提供科学依据，由此可见，区试工作责任重大。为防止试验数据的遗漏和失真，为品种审定工作提供科学公正的依据，因此，必须选择一批农学基础扎实、身体健康、热爱本职工作、具有较强的事业心和良好的职业道德，具备工作经验丰富的专业技术人员来负责水稻区试工作。试验前要对他们进行岗前业务培训，使他们明白水稻区试工作的重要性，要不断加强和提高他们的专业技术水平，提高思想素质和职业道德，增强承试人员的社会责任感，确保区试工作科学、公正、准确。

另外，区试主持单位每年要组织专家对各个试点进行不定期检查，对完成较好的试点进行表扬和奖励；对不负责任，人为造成试验报废和弄虚作假的试点，一经查实，对承试单位和试验负责人给予通报批评，严重的取消其承担区试资格。此外单位要对区试承试人员在职称、待遇、培训等方面给予照顾，激发他们工作的积极性和主动性，确保技术队伍相对稳定和整齐素质不断提高。2.3 供种单位要提供品种区试资料和优良种子

品种的特征特性是品种在种植过程中的具体表现。近年来，国家和省水稻区试主持单位给各区试点发放种子时，采用了品种编号，这样一定程度上避免了外界干扰，提高了试验结果的准确性，而另一面试验品种仅仅提供代蝙蝠蛾拟青霉(上接27页)结合成本因素综合考虑，

RCEF0936的最佳液体培养基组成为：A1B2C2D3，即葡萄糖2%，酵母浸出粉3%，硫酸锰0.05%，硫酸锌0.1%。2.5 培养基优化前后腺苷含量比较

试验中最佳的培养基组合并没有出现在正交表中，按照上述分析得到的最佳培养基组合进行验证，结果得到的蝙蝠蛾拟青霉菌株RCEF0936菌丝体中腺苷含量为2.85mg/g，比优化前的0.58mg/g提高了390%。经DPS统计分析软件对结果进行分析可知，两者差异极显著（P

号，没有提供详细的栽培技术资料，承试人员无从了解，单凭观察难免记载不准，描述不确切，品种的增产潜力也就很难充分表现出来。为充分发挥品种的各自潜力，育种者应对参试品种的生育期、特征特性提供详细地栽培技术资料。

为了不影响试验结果，参试单位在供种时提供的试验种子纯度和净度要好，供种数量要足，尽可能的不用包衣种子。

2.4 增加资金投入，加强试验基地建设

区域试验是基础性公益事业，政府应将经费纳入财政预算，加大资金投入并确保资金到位，以保证区试工作的正常开展。承试单位在有代表性的区域建立稳定的试验基地，同时也应改善工作条件，配有一定的犁田耙地、播种、收获脱粒等机械和必需的实验室仪器设备如干燥箱、天平、千粒板（千粒计数器）、水分测定仪、电子称、照相机、计算机等设备。

2.5 进行现场观摩，加强交流学习

为了对参试品种有一个真实的客观的感性认识，主持单位在作物生长季节有必要组织参试单位和承试单位的有关技术人员到各区试点进行实地考察，一方面加强交流学习，取长补短，不断改进各自的工作方法，另一方面对参试品种的丰产性、稳产性、抗逆性有一个客观真实的评价。

（徐爱民编、校）

利于菌体生长的培养基和有利于代谢物积累的培养基应该很难达到一致。而现在虫草类产品的规模化生产不仅要考虑产品的质量（单位重量菌丝体中活性成分的含量符合要求），也要考虑生产成本（单位体积发酵液中获得的菌丝体重量），因此，在产品质量合格的情况下，使代谢物绝对含量即单位发酵体积代谢物含量高的培养基是极具经济价值的。参考文献

[1]丁风平，姜文昌，陈宗娟．冬虫夏草的研究现状[J].中国生化药物 杂志，1994，15（4）：297-299.

[2]戴如琴，兰江丽，陈伟华，等.蝙蝠蛾拟青霉新种的研究[J].北京农 业大学学报，1989，15：221-224.

[3]戴如琴，兰江丽，陈伟华，等.冬虫夏草菌丝的分离培养及发酵工 艺的研究[J]．中药通报，1983，8（5）：7.

[4]姜文侠，孙武岳，马 琳，等.蝙蝠蛾拟青霉菌丝体发酵的研究[J]. 微生物学通报，1999， 26（3）：192-194.

[5]姜文侠，孙武岳，马 琳，等.蝙蝠蛾拟青霉菌丝体最适发酵条件 研究[J]．食用菌学报，1999，6（2）：38-40.

[6]韩玉梅，齐 勇，王清海，等.泰山虫草C-2最优液体培养条件筛 选[J]．菌物研究，2006，4（2）：11-15.

[7]张桂春，李绍龙，王淑芳，等.金顶侧耳液体培养基的优化筛选[J]. 山东农业大学学报：自然科学版，2006，37（3）：349-353.[8]国家药典委员会. 中华人民共和国药典:2005年版一部.北京：化 学工业出版社． （张宏民编、校）

3 结果与讨论

（1）试验结果表明，RCEF0936菌株高产腺苷的最佳培养基组合为葡萄糖2%，酵母浸出粉2%，硫酸锰0.05%，硫酸锌0.05%。试验中选择的4种因素对RCEF0936腺苷产量的提高都具有极显著的影响，微量营养因子是影响腺苷产量最主要因素，碳源的影响最小。另外，虽然酵母浸出粉对RCEF0936菌株菌丝体中腺苷含量的提高的促进作用在4个因子中不是最明显的，但是作为一种生物制品，它的质量是4种因子中最不稳定的，因此，选择适合的酵母浸出粉产品十分重要。（2）葡萄糖作为碳源时，是影响蝙蝠蛾拟青霉菌株RCEF0936生物量的主要因素，而对腺苷积累的影响相对而言要小的多。在试验中选择的3种葡萄糖的浓度下，低浓度的碳源有利于腺苷的积累，高浓度的碳源有利于菌体的生长。而作为微量因子的硫酸锌对腺苷的积累具有明显的促进作用，而它对菌体生长的影响却不显著。由此可见，有