猪流行性腹泻病毒部分S1基因克隆

《江西畜牧兽医杂志》2014年第6期

文章编号：1004-2342（2014）06-0011-03中图分类号：S852.65+9.6文献标识码：B

·实验研究·

猪流行性腹泻病毒部分Ｓ１基因克隆

王蓓，陈如圣，何后军，孙明，张祥华，潘美慧，熊加明，邬向东*，陈瑞光

（江西农业大学动科院，江西南昌330045）

摘要：作者采用RT-PCR 成功扩增了PEDV 的部分S1基因，并将其克隆至T 为研究江西省PEDV 流行株可能的变异情况，载体，经测序同源性分析，与PEDV 标准毒株同源性在95%以上，说明成功的克隆了PEDV 病毒部分S1基因，为将来进一步研究打下基础。

关键词：猪流行性腹泻；分子流行病学调查；同源性

猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV ）是引发猪流行性腹泻（Porcine Epi －demic Diarrhea, PED ）的原因。其属于冠状病毒科，冠状病毒亚科甲型冠状病毒属b 亚群[1]。PED 对于不同年龄段及不同品种的猪都容易感染，是猪的一种拥有高度接触性的传染病，以哺乳仔猪最为严重，死亡率可达100%，该病在我国及世界各养猪国家普遍分布。其主要的临床症状以食欲不振、水样腹泻、呕吐、脱水，最后酸中毒为基本特征。以往该病虽给养猪业造成了极其严重的影响，但病毒感染往往在一周后即基本恢复，病程较短[2]。但最近几年，该病在我国发生率明显升高，而且病程拖长，给养猪场造成极其严重的损失[3]。本研究根据NCBI 发表的PEDV 标准毒株序列设计引物，通过RT-PCR 方法，扩增出预期大小基因片段，经克隆测序，证实本研究成功克隆到PEDV-S1基因，为进一步研究其变异性提供了理论基础。1

材料与方法1.1材料

1.1.1病料来源。采集江西省南昌市某县猪场疑似病

基金项目：2012年江西省大学生创新训练项目（DC201313）；南昌市科技支撑项目（201-K JZC-NY-002）

作者简介：王蓓，女，江西农业大学动医专业学生，E-mail ：[email protected]

*通讯作者：邬向东，副教授，E -mail ：[email protected] 。

毒性腹泻仔猪的小肠组织及粪便样品。

1.1.2主要设备。K960型梯度PCR 扩增仪，5415R 型eppendorf 高速台式冷冻离心机，JY300C 型电泳仪、JY02S 型紫外分析系统，SPX-150B-Z 型上海博迅生化培养箱，DW-FL262型-40℃中科美菱超低温冷冻储存箱等。

1.1.3主要试剂。氨苄青霉素、LB 培养基、SDS 、Tris 碱等（Solarbio 公司产品）；EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ、PCR mix 、M-MLV 逆转录酶、RNA 酶抑制剂、dNTP 等（普洛麦格公司）；Trizol Kit 、DNA 凝胶回收纯化Kit 与PMD18-T Vector （大连宝生公司）。1.2方法

1.2.1PEDV 部分S1基因的RT-PCR 扩增方法建立1.2.1.1引物设计。根据GenBank 上已发表PEDV-S 基因序列设计引物，预期大小为1139bp ，由上海生工生物工程公司合成。引物序列：

P1：5'-------TTCACTGGTCATGGCACTGAC --------3'

P2：5'-------CTAACAGGCGTGTTGTAAAGC TG----3'

1.2.1.2病毒RNA 的提取。取约50mg 病料，加入有1mL 生理盐水的匀浆器中充分研磨后，12000×g 离心3min ，取上清用于总RNA 提取。

1.2.1.3PEDV 反转录反应体系。无菌2H 2O 4.5μL 、dNTP 4μL 、5×buffer 4μL 、P21μL 、RNA 酶抑制0.5μL 、M-MLV 1μL 、RNA 模板5μL 。反应条件：42℃

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《江西畜牧兽医杂志》2014年第6期

50min ，72℃15min ，获得cDNA 置-40℃冰箱保存备用。1.2.1.4RT-PCR 退火温度确定。反应条件：94℃预变性5min ；94℃45s ，56.3℃、57.1℃、57.9℃、59.0℃、60.0℃、61.1℃、62.2℃、63.3℃、64.2℃9个梯度45s ，72℃90s ，共35个循环；最后72℃延伸10min 。反应体系：无菌2H 2O 8.5μL 、cDNA 2μL 、PCR mix 12.5μL 、P11μL 、P21μL 产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察。1.2.1.5RT-PCR 反应敏感性检测。将cDNA 模板做10倍递度稀释，采用10~106倍稀释样品进行扩增，以无菌2H 2O 做空白对照，用优化后的RT-PCR 最佳的反应程序进行PCR 扩增，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳观察。

1.2.1.6RT-PCR 反应特异性试验检测：选择PEDV 、猪繁殖与呼吸障碍综合征病病毒（PRRSV ）、猪瘟病毒（CSFV ）阳性样品反转录的cDNA 、伪狂犬病病毒（PRV ）、猪圆环病毒（PCV2）阳性样品提取的DNA 作为PCR 反应模板，用优化后的最佳的反应条件进行扩增，设无菌2H 2O 为空白对照。1.2.2PEDV 部分S1基因克隆及同源性分析1.2.2.1PEDV 部分S1基因PCR 扩增。以保存的cDNA 为模板进行PCR 扩增。反应体系同1.2.1.4。应用1.2.1优化的反应条件进行PCR 反应，产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察。

1.2.2.2目的片段回收及载体连接。将待回收的PEDV-S1基因DNA 片段在90V 电压45min 1%琼脂糖凝胶电泳分离后，利用TaKaRa 公司DNA 回收试剂盒回收纯化DNA 片段。回收片段与PMD18-T Vector 载体进行连接，连接反应的体系如下。

PMD18-T Vector 目的片段PEDV-S1dd H 2O Solution ⅠTotal

1.0μL 3.0μL 1.0μL 5.0μL 10.0μL

·实验研究·

培养12~16h 。再将新鲜生长的转化菌落转接至LA 液体培养基，参照分子克隆实验指南[4]碱裂解法提取转化质粒。EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切鉴定重组质粒，酶切体系如下。

10×buffer EcoR ⅠSal Ⅰ质粒DNA dd H 2O Total

1.0μL 1.0μL 1.0μL 4.0μL 3.0μL

重组质粒酶切37℃水浴2h 后，1%琼脂糖凝胶电泳观察，分析酶切产物。

1.2.2.5基因序列的测定与分析。将经双酶切鉴定为阳性的重组菌液，送上海生工生物公司进行克隆基因测序，所得结果利用SeqMan 软件进行基因序列的拼接。根据所得到的基因序列，利用DNAStar 软件分析其流行特征，并且与标疫苗株进行同源性分析。2

结果

2.1PEDV 的部分S1基因RT-PCR 扩增方法建立结果

2.1.1PEDV RT-PCR 反应最适退火温度的试验结果，见图1。

56.3℃、Lane 2：57.1℃、Lane 1：

Lane 3：57.9℃、Lane 4：59.0℃、Lane 5：60.0℃、Lane 6：61.1℃、Lane 7：62.2℃、Lane 8：63.3℃、Lane 9：63.3℃

M ：Marker 100bp Ladder

图1PEDV

最佳退火温度电泳图

2.1.2PEDV RT-PCR 敏感性试验结果见图2。

100、Lane 2：10-1、Lane 1：

10-2、Lane 4：10-3、Lane 3：

10-4、Lane 6：10-5、Lane 5：H 2O Lane 7：

M ：Marker 100bp Ladder

轻轻混匀，置16℃水浴锅中连接2h ，然后将其放置于-20℃保存备用。

1.2.2.3连接产物的转化。参考分子克隆实验指南方法制备感受态细胞，采用CaCl 2转化法进行，将连接S1基因的克隆载体PMD18-T -S1转入宿主菌DH5α。

1.2.2.4重组菌的鉴定。用无菌牙签随机挑取转化菌落，转接含氨苄青霉素的LB （LA ）培养基37℃恒温

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图2PEDV 敏感性检测电泳图

《江西畜牧兽医杂志》2014年第6期2.1.3PEDV RT-PCR 特异性试验结果见图3。

Lane 1：PEDV 、Lane 2：CSFV 、Lane 3：PRSSV 、Lane 4：PCV-2、Lane 5：PRV 、Lane 6：H 2O

M ：Marker 100bp Ladder

·实验研究·

2.3.3PEDV 部分S1基因克隆测序结果与同源性分析。南昌地区PEDV 流行株S1基因与比利时标疫苗株CV777的同源性为95.7%，证实本试验克隆的外源基因为PEDV 部分S1基因。3小结与讨论

3.1本试验建立了PEDV 部分S1基因的RT-PCR 扩增方法，经测序分析，与PEDV 标准疫苗毒株同源性在95.7%，证实成功克隆PEDV-S1基因。3.2本试验建立的PEDV 基因扩增方法具有较好的灵敏度和特异性，也可以应用该法对可疑病毒性腹

图3PEDV

引物特异性电泳图

泻仔猪病料进行检测，本试验组从采集自江西省南昌市44份病料进行的检测中发现，PEDV 阳性率在63.64%。

参考文献：

[1]陆承平主编，兽医微生物学（第五版）[M].北京：中国农业出版社，2013.

[2]蔡宝祥主编，家畜传染病学（第四版）[M].北京：中国农业出版社，2008.

[3]徐国栋，李峰，张广峰. 国内猪流行性腹泻防治概况[J].畜牧与兽医，2012（12）：10～12.

[4]J.莎姆布鲁克[美]著. 黄培堂译. 分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，2005.

[5]王晓梦，牛贝贝，燕贺等. 2010～2012年中国猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析[C].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集，徐州，2013.10.21.

[6]董世娟, 朱于敏, 于瑞嵩，等. 我国PEDV 分子流行病学研究进展[C].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集，徐州，2013.10.21. [7]孙明. 江西省PEDV 分子流行病学调查[D].江西农业大学硕士论文，南昌，2014.

（收稿日期：2014-09-26

）

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2.2猪流行性腹泻病毒部分S 基因的克隆及序列流行病学分析结果

2.3.1PEDV 部分S1基因的RT-PCR 扩增结果。样本cDNA 模板在最优条件下进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳观察结果如图4。可见一条约1100bp 的DNA 片段，与预期的DNA 片段大小一致。

Lane1：PEDV

M ：Lambda DNA/HindIII

图4S 基因的PCR

扩增

2.3.2PEDV-S1基因克隆与鉴定。提取的重组克隆质粒DNA ，用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳观察，结果如图5。可见重组克隆质粒经双酶切后，有一条大片段（克隆载体DNA ，约3000bp ）和一小片段（插入的PEDV 部分S1基因片段，约1100bp ）。

农业部组织开展Ｈ７Ｎ９流感防控督查

正值H7N9流感高发季节，全国防控当前，

Lane1：PMD-18-S1双酶切Lane2：PMD-18-S1质粒M ：Lambda DNA/HindIII

工作进入关键时期。为进一步加强H7N9防控工作，根据全国动物H7N9流感防控工作视频会议安排，近期，农业部将派出定点联系工作组，赴重点省份开展H7N9防控工作集中督查，督促各地切实落实各项防控措施。

(本刊辑)

图5S 基因重组质粒酶切鉴定

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