人ABO血型鉴定和血细胞标本的制备和观察

人ABO 血型鉴定和血细胞标本的制备和观察

1. 实验内容

● 血型的鉴定。

● 人血凃片标本的制备、观察。

● 人血细胞永久切片标本的观察。

2. 实验目的

● 学习巩固显微镜的使用方法。

● 学习掌握人血涂片标本制备的方法，并了解人血细胞的类型和形态。 ● 了解血型测定的方法原理，学习玻片法测定ABO 血型。

3. 实验背景

3.1科勒照明：光学显微镜的一般原理

科勒照明系统（kÖhler illumination）是由德国的动物学家August KÖhler于1893年发明的。相对于传统的临界照明（Critical Illumination），科勒照明系统在样品的视野范围内减少了内部散射光，控制了反差和深度，更有效的提供了中心亮视野照明。

3.1.1光学显微镜的基本构造

光学显微镜的基本结构包括机械、照明和光学三部分（图1，表1）。显微镜的放大作用是由物镜和目镜共同完成的。标本经物镜放大后，在目镜的焦平面上形成一个倒立的实像，再经目镜的进一步放大形成一个虚像，被人的眼睛所观察到。每台显微镜一般有3~4个物镜，可分为低倍镜（如4×，10×），高倍镜（如

40×）和油镜（100×）。目镜通常有5×、10×和15×三种。目镜只起着放大作用，而物镜决定显微镜的分辨率。物镜外壳上通常标有放大倍数、数值孔径、镜筒长、盖玻片的厚度和使用条件等性质参数。如标有“oil，N.A.1.30，100×，160/0.17”的物镜表示数值孔径为1.3，放大倍数为100倍的油镜。其要求镜筒长为160 mm，盖玻片的厚度为0.17 mm。数值孔径（Numerical Aperture）是决定显微镜分辨率的最重要参数。

图1 LEICA EME型生物显微镜的构造（http://www.gsau.edu.cn/）

表1 显微镜的基本结构

显微镜部分

机械部分 具体部件名称 镜座、镜柱、镜臂、镜筒、物镜转换器，

载物台、调节器

照明部分

光学部分

光源部分（反光镜或电光源）、聚光器 物镜、目镜

3.1.2 显微镜的分辨率

（1）瑞利极限（Rayleigh limit）：光学显微镜的最大分辨率为0.2 μm。根据瑞利极限计算显微镜的分辨率如下式：

d=0.61λ/N.A.(N.A.=n·sinθ)

式中，d 为分辨距离，单位μm；λ为照明光线的波长；N.A. 为数值孔径；n 为介质的折射率；θ为物镜镜口角的一半的角（镜口角是通过样品的光线延伸到物镜光孔边缘所成的角）。

从式中可见，可通过缩短使用光波长或增加数值孔径来提高分辨率。

电子显

微镜的光源是比可见光波长短10万倍的电子束，所以其分辨率可达0.2~0.3 nm。可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察，所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的。从公式中可知：提高数值孔径有两种方法，一是增大镜口角，二是增大物镜与标本之间的折射率。采取前一种方法时，可以让标本与物体尽量靠近。但无论怎样靠近，镜口角总是小于180°，sin θ总小于１。采取后一种方法时，可在物镜与标本之间加入折射率较大的介质。当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。因此，油镜的数值孔径较大，分辨率较高。

（2）显微镜的放大率：显微镜的总放大率一般为物镜与目镜放大倍数的乘积。总放大倍数要和数值孔径匹配，应在500-1000 N.A.值之间，此为有效放大范围。

（3）照明系统对分辨率的影响：聚光器是照明系统中的重要部件，调节不当不但可影响照明的均匀性，还会降低显微镜的分辨率，直接影响图像的反差。因此，在使用显微镜观察标本前，首先需要调节照明系统，主要通过聚光器的调节控制光线照明物体的光锥角度，以得到最佳的分辨率和反差。

3.1.3 显微镜的使用方法

（1）调节照明系统：通过调节光亮调节器、聚光镜的上下位置及虹彩光圈(孔径光阑) 使视野内的光线均匀，亮度适中。因其最佳调节很大程度上取决于标本固有的反差特征，所以在观察标本时还要随时调整照明系统，以达到最佳效果。当照明光束与显微镜的光轴不在同一轴线上时，还需通过调节聚光镜中心调节旋钮进行合轴调节（centering adjustment）。调好后，不要再随意调节中心调节旋钮。

（2）低倍镜观察：将标本片固定在载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。旋转转换器，将低倍物镜调至光路中央。旋转粗调节旋钮将载物台升起，从侧面注视小心调节物镜接近标本片约5 mm处，然后用目镜观察，慢慢降载物台，直至视野中出现清晰的图像为止。

（3）高倍镜观察：在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心，轻轻转动物镜转换器，将高倍镜移至工作位置。调节照明系统后微调细调节旋钮使物像清晰。

（4）油浸镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域，先用粗调节旋

钮下降载物台，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加一滴香柏油，从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台小心地上升，使油浸镜浸在香柏油并几乎与标本片相接触。将聚光镜升至最高位置并开足光圈，慢慢地降载物台至视野中出现清晰图像为止。

（5）使用后的整理：下降载物台，取下载玻片，转动转换器使物镜与通光孔错开。下降聚光镜，以免物镜和聚光镜发生碰撞危险。关闭光圈，关闭开关，拔掉插头。有些显微镜有内置蓄电池，故即使拔掉插头也一定要关闭开关。

（6）使用中的注意事项

① 养成良好习惯。比如要双目观察；转换物镜时要轻轻转动转换器，不要扳着物镜转动等等。

② 制作目镜上的指示针。在演示或考查学生观察效果时，最好用带有指示针的目镜。简易的做法是：轻轻拆开目镜，将一根短头发的一端用胶水粘在目镜内侧的边缘，另一端指向目镜的圆心附近。观察时，轻轻地转动目镜，指示针就能够指出视野内的不同部位。

③ 要用擦镜纸擦拭物镜和目镜。用完油镜后用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（或乙醚∶无水乙醇＝1∶1）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的清洁液。

3.2 血细胞和血型的一般知识

血细胞包括红细胞、白细胞和血小板三类细胞，它们均起源于造血干细胞。红细胞：主要的功能是运送氧。直径7～8.5μm，呈双凹圆盘状，中央较薄（1.0μm），周缘较厚（2.0μm），故在血涂片标本中呈中央染色较浅、周缘较深。白细胞：主要扮演了免疫的角色。体积比红细胞大，光镜下，根据白细胞胞质有无特殊颗粒，可将其分为有粒白细胞和无粒白细胞两类。有粒白细胞又根据颗粒的嗜色性，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞用嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有单核细胞和淋巴细胞两种。血小板：止血过程中起着重要作用。它是骨髓中巨核细胞胞质脱落下来的小块，故无细胞核，表面有完整的细胞膜。血小板体积甚小，直径2～4μm。在血涂片中，血小板常呈多角形，聚集成群。在正常生理情况下，血细胞和血小板有一定的形态结构，并有相对稳定的数量。

血型物质的化学本质是指构成血型抗原的糖蛋白或糖脂，而血型的特异性主要取决于血型抗原糖链的组成。

A 抗原 O 抗原 B 抗原

图2 ABO血型的抗原类型简图

红细胞膜上的A 抗原与另一人体内血浆中的抗A 抗体相遇或B 抗原与抗B 抗体相遇时会发生红细胞凝集反应。故可利用已知含抗A 凝集素和抗B 凝集素的诊断血清，分别与被测者的红细胞混合，根据是否发生红细胞凝集反应，判断红细胞所含的凝集原，从而鉴定其血型。

4. 实验材料与试剂

（1）材料：永久制片。

（2）设备与用品：普通光学显微镜，滴管，载玻片，盖玻片，滤纸，擦镜纸，牙签等。

（3）药品与试剂：香柏油，乙醚，乙醇，瑞氏粉，甲醇等。

试剂配制：

瑞氏（Wright ）染液：瑞氏粉0.1 g加60 mL甲醇研磨溶解，存于棕色瓶中，一周后使用。密封保存可长期使用。

5. 实验方法与步骤

（1）血型测定

取一干净双凹玻片或普通载玻片，用75%酒精棉球等消毒耳垂或指端后，用一次性针刺破皮肤，挤两滴血分别滴加在玻片两侧。立即向血滴中分别滴加A 血型和B 血型抗体，注意不要让抗体试剂瓶口接触到血液，以免污染抗体。用牙签

使其充分混匀。放置1-5分钟后用肉眼观察有无凝集现象，根据有无凝集现象判定血型。

（2）人血涂片制备

从指腹取第二滴血（第一滴血因含白细胞过多，挤去）滴加于载玻片一端。另拿一干净载玻片，其窄边接触样品，使其在两载玻片接触处展成线状。以约45°角轻推载玻片，使样品展成一薄层血膜。注意推片动作要连贯，血片的厚度依血滴大小、推片速度和两片夹角而定。血滴小，速度慢，夹角小则血片薄。待血片晾干后，滴加瑞氏染液A 液（黑瓶）用嘴吹散染液，染色一分钟；再加B 液（白瓶）染色5-10分钟，用水轻轻冲去染液后，待晾干观察。

油镜下，红细胞呈圆盘状，中央薄，无核，着色浅，数量多；白细胞多为胞质淡蓝色，核为深蓝或紫色；白细胞核形态多样，有叶形，肾形或圆形等，颜色也因为酸碱性质不同而深浅不一。血小板染成紫红色，不规则。

图3 涂片方法示意图

图3 人血涂片（400×）

6. 实验注意事项

（1）注意推片动作要连贯，血片的厚度依血滴大小、推片速度和两片夹角而定。血滴小，速度慢，夹角小则血片薄。

（2）扎出血液后，要立即先将进行鉴定血型和血涂片的血液滴在载玻片上，再进行其它操作，以免血液凝固后无法采血。

（3）采血前可以适当揉搓手指采血部位；采血后可适当挤一下针眼，促使血液流出量稍增加，用以鉴定和涂片。