DNA提取试剂盒步骤--最新

组织基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型）

储存条件

该试剂盒置于室温（15-25℃）干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于 2-8℃。2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时 间，必要时可在37℃水浴中预热10 min，以溶解沉淀。

注意事项

1．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在缓冲液GD 和漂洗液PW 中加入无水乙醇。

2．样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA 片段较小且提取量也下降。

3．若缓冲液GA 或GB 中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。

4．所有离心步骤均为使用台式离心机，室温下离心。

操作步骤

使用前请先在缓冲液GD 和漂洗液PW 中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

1. 处理材料

用干烤过的镊子和剪刀剪取一定量的冰冻组织，体积约两个绿豆大小，放入

DNAase-free 的1.5ml EP中。向EP 管中加入等体积的磁珠，以及加入200 μl缓冲液GA ，振荡悬浮。置于组织破碎仪中运行5mins/次，共3次。每破碎一次，需将含组织的EP 管放入离心机中短暂离心来沉淀组织和磁珠，使其在下次破碎时更好的接触。可根据观察匀浆的效果来决定匀浆的次数，目标是“碾磨均匀”，不能有较大体积的组织块（>2mm的组织块）。

如果需要去除RNA ，需加入4 μl RNaseA （100 mg/ml）溶液（客户自备，目录号：RT405-12），振荡15 sec，室温放置5 min。

2. 加入20 μl Proteinase K溶液，混匀。提取组织基因组时，加入Proteinase K混匀后，在56℃放置1~3 h，直至组织溶解，每小时颠倒混合样品2-3次，用水浴振荡器也可。放入10,000rpm (~11,500×g) 的离心力高速离心1mins 来沉淀未碾碎的组织和磁珠。将上清转移至新的EP 管中。

3. 加入200 μl 缓冲液GB ，充分颠倒混匀，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。注意：加入缓冲液GB 时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA 量少和提取出的DNA 不纯。

4. 加人200 μl 无水乙醇，充分振荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中）， 12,000 rpm (~13,400×g) 离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6. 向吸附柱CB3中加入500 μl 缓冲液GD （使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g) 离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7. 向吸附柱CB3中加入600 μl 漂洗液PW （使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000 rpm (~13,400×g) 离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8. 重复操作步骤7。

9. 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm (~13,400×g) 离心2 min，倒掉废液。将吸附柱 CB3置于室温放置5mins ，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。

10. 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μ（100ul ）洗脱缓冲液TE ，室温放置2-5 min，12,000 rpm (~13,400×g) 离心 2 min，将溶液收集到离心管中。为增加基因组DNA 的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心2 min。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μl ，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O 做洗脱液应保证其pH 值在7.0-8.5范围内，pH 值低于 7.0会降低洗脱效率；且DNA 产物应保存在-20℃，以防DNA 降解。

11. 溶解的DNA 样品其 A260/280 比值

若要长期保存DNA 样本，最好加入相应2.5倍体积的无水乙醇来沉淀DNA 。混匀后便可看见白色絮状物。短暂离心后放置于-80℃低温冰箱中保存至少一年。

若需使用，需在7000~8000×g 的离心机中离心5min ，使DNA 重新沉淀，再加入TE 溶液溶解DNA 沉淀。必要时须重新检测DNA 的纯度和浓度。

DNA/RNA纯品的OD260/OD280为1.8或2.0，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA 的纯度。若比值较高说明含有RNA ，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。

DNA: OD260/OD280比值应接近1.80，若R 值大于1.8。说明存在RNA ，可重新用RNaseA 处理。若R 值小于1.8，则说明有蛋白质等杂质存在，需再用蛋白酶K 、SDS 及盼、氯仿、异戊醇重新对DNA 进行纯化（也可加入1/8体积的3M NaAc(pH5.2)与冷乙醇一同促使DNA 沉淀析出。

RNA: OD260/OD280比值在1.8-2.0时，认为RNA 中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris 作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于2（一般应该是2.2时，说明RNA 已经水解成单核酸了。