动物线粒体基因组的转录物作图与应用

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《生命的化学》２０１０年３０卷３期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＯＦ　ＬＩＦＥ　２０１０，３０（３）

●　Ｍｉｎｉ　Ｒｅｖｉｅｗ

文章编号：　　１０００－１３３６（２０１０）03－0434-04

动物线粒体基因组的转录物作图与应用

姚　杨　　黄　原

陕西师范大学生命科学学院，西安　７１００６２

摘要：线粒体转录物作图是研究线粒体基因组表达、调控和序列注释的基础。目前用于线粒体转录组分析的方法主要有表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ，　ＥＳＴ）文库测序、５’和３’cＤＮＡ末端快速扩增（ｒａｐｉｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡｅｎｄｓ，　ＲＡＣＥ）技术和ＲＴ－ＰＣＲ方法，采用这些方法已经对果蝇（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、按蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ　ｆｕｎｅｓｔｕｓ）、玻璃海鞘（Ｃｉｏｎａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、猪（Ｓｕｓ　ｓｃｒｏｆａ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）等线粒体转录组进行了分析。研究显示，脊椎动物和无脊椎动物的线粒体基因组分别产生３个和５个多顺反子的初级转录物，并通过ｔＲＮＡ间断模型（ｔＲＮＡ　ｐｕｎｃｔｕａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ）加工。线粒体转录物的分析结果为正确注释线粒体基因组序列提供了重要信息。关键词：后生动物；线粒体转录物；ｔＲＮＡ间断模型；基因组注释中图分类号：Ｑ５２

大多数后生动物的线粒体ＤＮＡ都编码１３个蛋白质基因，两个ｒＲＮＡ基因和２２个ｔＲＮＡ基因。另外，还有一个较大的非编码区域，在脊椎动物称为Ｄ环区或者控制区，在节肢动物称为Ａ＋Ｔ富集区，它们在功能上同源。

自１９８１年人类线粒体基因组序列被第一个测出以来，至近期已经有１８７４种后生动物的线粒体基因组序列被测出（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＯＲＧＡＮＥＬＬＥＳ／）。目前几乎所有后生动物纲都至少有一个物种的线粒体基因组序列被测出。对这些新测出的线粒体基因组的注释大多采用以序列比对为基础的生物信息学方法。我们实验室在注释所测定的昆虫和鸟类线粒体基因组序列过程中，发现采用生物信息学方法的注释存在许多问题，包括：多顺反子转录单位的数目、起始与终止部位；重叠基因的转录与加工成熟机制；基因间隔序列的切除机制；转录和复制调控序列；部分蛋白质基因（主要是ｃｏｘ１）的起始密码子和终止密码子；ｌｒＲＮＡ（ｌａｒｇｅ　ｒＲＮＡ）和ｓｒＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｒＲＮＡ）的起始与终止位置；ｔＲＮＡ二级结

收稿日期：２０１０－０１－２５

国家自然科学基金项目（Ｎｏ．　３０６７０２７９和３０９７０３４６）资助作者简介：姚扬（１９８５－），女，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｏｙａｎｇ１２２０＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ；黄原（１９６２－），男，教授，通讯作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕａｎｈ＠ｓｎｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

构上非配对碱基、编码非典型ｔＲＮＡ二级结构的基因、疑似／额外ｔＲＮＡ的是否存在等等。基因组注释中遇到的这些问题都必须通过实验的方法解决，其中最直接的方法就是线粒体转录组的分析（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄ－ｒｉａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｍａｐｐｉｎｇ），也称为线粒体转录物作图。

线粒体转录物作图就是将存在于线粒体内的ＲＮＡ分子测序后定位到线粒体基因组序列上。转录物包括直接从ＤＮＡ上转录得到的初级转录物、处于加工过程的中间产物和加工后的成熟转录物。在转录图上，初级转录物可以让我们了解线粒体基因组的所有转录单位的起始和终止位置，加工中间产物系列显示了线粒体转录物加工顺序和步骤，而成熟转录物可以显示出基因边界和ＲＮＡ上发生的编辑等。此外，转录物作图还可以获得各转录产物的相对数量，对于了解转录起始位点和调控机制有重要价值。所以，转录物作图是研究线粒体基因组表达、调控和序列注释的基础。１．　线粒体转录物分析方法

自２０世纪８０年代以来，研究人员即开始采用放射性同位素标记技术进行线粒体基因组的体内或体外转录实验，这些早期的研究让人们了解了一些模式生物线粒体的转录。目前用于线粒体转录组分析的方法主要有表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ，

●　小综述

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ＥＳＴ）文库测序、５’和３’ｃＤＮＡ末端快速扩增（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄ，　ＲＡＣＥ）技术和ＲＴ－ＰＣＲ方法。此外，从原理上第二代高通量转录组测序技术是最适合于线粒体转录组分析的方法，但目前还没有报道。

线粒体ＥＳＴ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ＥＳＴ，　ｍｔＥＳＴ）方法是普通ＥＳＴ测序的副产品，就是将ＥＳＴ文库测序结果中所有线粒体来源的片段汇集起来，拼接为重叠群单元（ｃｏｎｔｉｇ）作为线粒体转录产物进行分析。由于细胞中线粒体含量较多，所以ＥＳＴ文库中的ｍｔＥＳＴ数量所占的比例很大。此类研究有果蝇（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）［１］、按蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ　ｆｕｎｅｓｔｕｓ）［２］、尾索动物亚门玻璃海鞘（Ｃｉｏｎａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）和真海鞘（Ｈａｌｏｃｙｎｔｈｉａｒｏｒｅｔｚｉ）［３］、２种蝾螈（Ａｍｂｙｓｔｏｍａ　ｍｅｘｉｃａｎｕｍ）和（Ａ．ｔｉｇｒｉｎｕｍ）［４］和猪（Ｓｕｓ　ｓｃｒｏｆａ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）［５］等。例如，中国－丹麦协作的猪基因组计划的ＥＳＴ文库获得６８５，０００ＥＳＴ序列，其中的４１，４９９　ＥＳＴ（总ＥＳＴ序列的６％）序列来自线粒体基因组，序列拼接后产生３５个重叠群单元和２３个单独ＥＳＴ，拼接结果覆盖了猪线粒体基因组全序列的９４％［５］。

采用ＲＡＣＥ和ＲＴ－ＰＣＲ分析ｍｔＥＳＴ时，首先需要获得无ＤＮＡ污染的线粒体ＲＮＡ，然后根据每个基因或转录物的３’和５’端序列设计出ＰＣＲ引物，分别进行５’和３’ＲＡＣＥ和ＲＴ－ＰＣＲ扩增，获得的产物克隆后测序。这种方法步骤比较繁复，需要的引物数量大，仅在黑腹果蝇中进行过研究［１］。２．　动物线粒体转录物分析

哺乳动物线粒体ＤＮＡ的转录是研究得最深入的。位于控制区的重链启动子２（Ｈ－ｓｔｒａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　２，Ｈｓｐ２）和轻链启动子（Ｌｓｐ，　Ｌ－ｓｔｒａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）各转录几乎与线粒体基因组一样大小的多顺反子，并通过ｔＲＮＡ间断模型（ｔＲＮＡ　ｐｕｎｃｔｕａｔｅｄ　ｍｏｄｅｌ）加工。从重链的另一个启动子Ｈｓｐ１起始的转录终止于ｌｒＲＮＡ基因下游的ｔＲＮＡ基因处，这样可以增加包含两个ｒＲＮＡ亚基的ＤＮＡ片段的相对转录速率。

人类线粒体ＤＮＡ有两个相互重叠的重链转录起始点（Ｈｓｐ１和Ｈｓｐ２）和一个轻链转录起始点（Ｌｓｐ），它们都位于Ｄ－环区域，转录产生３条初级转录物Ｈ１、Ｈ２和Ｌ。Ｈ１链从ｔＲＮＡｐｈｅ上游１９个核苷酸处开始，到１６Ｓ　ｒＲＮＡ的３’末端，主要转录１２Ｓ　ｒＲＮＡ、１６Ｓ　ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡｐｈｅ和ｔＲＮＡｖａｌ基因。Ｈ２链从１２Ｓ　ｒＲＮＡ　５’端开始

几乎涵盖了整条的Ｈ链，转录１４种ｔＲＮＡ和１２种ｍＲＮＡ。Ｌ链转录起始点位于１２Ｓ　ｒＲＮＡ的５’末端，转录产物是８种ｔＲＮＡ和ＮＤ５基因（图１）［６］。Ｈ１链和Ｌ链在转录起始区都有一个大约１５　ｂｐ的５’－ＣＡＮＡＣＣ（Ｇ）ＣＣ（Ａ）ＡＡＡＧＡＹＡ－３’和一个位于上游起始区−１２￣−３９ｂｐ可以结合转录因子的区域来加速转录。Ｈ２链仅有一个类似于Ｈ１链和Ｌ链的１５　ｂｐ的启动子结合区域。Ｈ１链的转录效率要比Ｈ２链的转录效率高２０倍，所以Ｈ链中ｒＲＮＡ的合成速率要比ｍＲＮＡ高。Ｈ１和Ｈ２的转录是独立的。

无脊椎动物中只有昆虫进行过线粒体转录物的分析。黑腹果蝇（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）线粒体基因组有５个转录启始位点，２个位于Ｊ链（分别在ｔＲＮＡＩｌｅ和ｔＲＮＡＴｈｒ上游），３个位于Ｎ链（分别在ｓｒＲＮＡ上游，ｔＲＮＡＰｒｏ上游的ＮＤ６基因及位于ｔＲＮＡＣｙｓ和ｔＲＮＡＴｙｒ上游的ｃｏｘ１基因）。转录启始于５个位点中的任意一个，一直持续至转录终止位点，此转录物通过ｔＲＮＡ间断模型被加工成１１个ｍＲＮＡ，２２个ｔＲＮＡ和２个ｒＲＮＡ。

尽管动物线粒体转录组的研究比较少，但从这些研究中得到了一些重要的结果，包括：（１）动物线粒体的转录物是多顺反子的。（２）昆虫线粒体有５个转录单位，而哺乳动物有３个。（３）动物线粒体成熟的ｍＲＮＡ通常是单顺反子形式，３’端具有５０~6０　ｂｐ长的多聚腺苷，但缺少细胞质成熟转录物的５’帽子特征。但２对重叠基因（ａｔｐ８／ａｔｐ６和ｎａｄ４Ｌ／ｎａｄ４基因）也存在着３’多聚腺苷化的二顺反子（ｂｉ－ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）。（４）可能不存在４个以上碱基的起始密码子。按蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓｆｕｎｅｓｔｕｓ）线粒体ＥＳＴ分析证实ｃｏｘ１基因的起始密码子为ＴＣＧ，ｎａｄ１的起始密码子为ＴＴＧ，ｎａｄ５基因为ＧＴＧ［２］。（５）动物线粒体中ｒＲＮＡ基因的转录效率高于其他基因。成熟１２Ｓ和１６Ｓ　ｒＲＮＡ的３’具有长度可变的多聚腺苷尾，在１６Ｓ　ｒＲＮＡ中尤其普遍。（６）在线粒体基因组中，ＡＧＡ和ＡＧＧ密码子没有相应的ｔＲＮＡ，这样的密码子被称为饥饿密码子（ｓｔａｒｖｉｎｇ　ｏｒ　ｈｕｎｇｒｙｃｏｄｏｎｓ）。饥饿密码子是指缺少或没有氨基酰ｔＲＮＡ（ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ）供给的密码子。在饥饿密码子位置上蛋白质合成的正常步骤发生改变，导致几种不正常的途径，包括与非同族（ｎｏｎｃｏｇｎａｔｅ　ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡｓｐｅｃｉｅｓ）的氨基酰ｔＲＮＡ结合，向上游（−１位）或下游（＋１位）的移码（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｉｎｇ）翻译、向下游几个密码子的移码翻译和肽酰ｔＲＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｙｌ　ｔＲＮＡ）释放等。已

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图１　脊椎动物线粒体基因组的２个主要初级转录物及加工后的成熟转录物图谱［６］

来自Ｈ－链的转录物编码了大多数的基因，Ｌ－链只编码８种ｔＲＮＡ和ＮＤ５基因。成熟ｔＲＮＡ具体位置仅标记在Ｌ－链和Ｈ－链上［６］。

经证实人类线粒体基因组被注释为ｃｏｘ１和ｎａｄ６基因终止密码子的ＡＧＡ和ＡＧＧ，其实就是一种饥饿密码子，在线粒体核糖体翻译过程中起饥饿密码子的作用，拖延核糖体的正常移动，而产生一个−１方向的移框（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ），从而使用正常的ＵＡＡ和ＵＡＧ作为终止密码子［７］。

３．　动物线粒体转录后加工模型

已经从人类细胞系线粒体中全面了解到动物线粒体转录产物的加工。在人类线粒体基因组中，几乎所有ｍＲＮＡ种类通过从大的转录物中准确切割ｔＲＮＡ产生。包含在初级转录物中的ｔＲＮＡ可位于ｍＲＮＡ的　３’或５’端，并且作为最重要的线粒体ＲＮＡ加工信号，被类似于ＲＮＡ酶Ｐ和ＲＮＡ酶Ｚ的ｔＲＮＡ加工酶识别，并分别从３’和５’端剪切，从多顺反子性的前体ＲＮＡ释放侧翼的ＲＮＡ分子。Ｏｊａｌａ等［８］据此提出了ｔＲＮＡ间断模型来解释人类线粒体基因组多顺反子转录物的加工机制。大的转录物通过ｔＲＮＡ间

断模型加工，插入的ｔＲＮＡ分子成熟释放之后被加工成成熟的ｒＲＮＡ和ｍＲＮＡ分子。ｍＲＮＡ需要多聚腺苷酸化的来稳定ｍＲＮＡ和完善部分基因的终止密码子。

ｔＲＮＡ间断模型是目前被广泛认同的线粒体转录物加工模型，被广泛用于动物、真菌和红绿藻的线粒体转录后加工。该模型中，散布于线粒体基因组上的ｔＲＮＡ基因就如同文本的标点分隔开不同的基因。ｔＲＮＡ从初级转录物上被加工分离出来后，剩余的片段就是ｍＲＮＡ和ｒＲＮＡ基因。这就要求这些基测在３’端被加工的惟一的ｍＲＮＡ，它的加工位点发生在编码ＴＡＧ终止密码子下游的果蝇线粒体转录物末端因子ＤｍＴＴＦ区域，在此区域没有发现其他ＲＮＡ，表明此因子也参与ＲＮＡ的加工，或者转录终止事件产生正确的３’末端。对于所有的ｍＲＮＡ，包括５’末端有非编码碱基的基因，５’末端以此基因第一个被翻译的密码子的第一位开始。而ｃｏｘ１

基因的

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５’末端是第一个框内有义密码ＵＣＧ，表明这些密码子被用做起始密码。框内的终止密码ＴＡＡ在ｃｏｘ１和ｃｏｘ２基因之前，功能阻止框内这些基因在加工完全之前被翻译。

Stewart 等[1]对果蝇线粒体基因组所有大转录物的末端序列研究显示，即便出现非编码碱基，tRNA 标点模型通常也能精确预测大多数mRNA 和rRNA 分子3’末端，5’末端非编码碱基通常在RNA 加工过程中被去除。果蝇线粒体基因组两个rRNA 中各自有1个3’tRNA标点加工位点，mRNA 中有9个，并且包含两个蛋白质编码基因边界，atp6和cox3之间被注释的基因边界是这两个mRNA 基因的加工位点。

参　考　文　献

［１］Ｓｔｅｗａｒｔ　ＪＢ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｔｕｒｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ

ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　ｉｎ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｔＲＮＡｐｕｎｃｔｕａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ　ｉｎ　ａｒｔｈｒｏｐｏｄｓ．　Ｇｅｎｅ，　２００９，　４４５：　４９－５７

［２］Ｋｒｚｙｗｉｎｓｋｉ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ

ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ　ｆｕｎｅｓｔｕｓ：　ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｄｉｐｔｅｒａｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａ　ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｏｆ　ｍｏｓｑｕｉｔｏ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．　Ｍｏｌ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｅｖｏｌ　２００６，　３９：４１７－４２３

［３］Ｇｉｓｓｉ　Ｃ　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ　ｏｆ

ａｓｃｉｄｉａｎ　ｍｔＤＮＡ　ｕｓｉｎｇ　ＥＳＴ　ｄａｔａ．　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ，　２００３，　１３：２２０３－２２１２

［４］Ｓａｍｕｅｌｓ　ＡＫ　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ

ｆｉｖｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｍｂｙｓｔｏｍａｔｉｄ　ｓａｌａｍａｎｄｅｒ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｇｅｎｏｍｅｓ．　Ｇｅｎｅ，　２００５，　３４９：　４３－５３

［５］Ｓｃｈｅｉｂｙｅ－Ａｌｓｉｎｇ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．　ＥＳＴ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｐｉｇ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ

ｒｅｖｅａｌｓ　ｎｏｖｅｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌａｎｄ　ａｄｕｌｔ　ｔｉｓｓｕｅｓ．　ＢＭＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　２００７，　８：　３６７

［６］Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒ　ＩＥ．　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　２ｎｄ　ｅｄ．　２００８，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，

Ｉｎｃ．

［７］Ｔｅｍｐｅｒｌｅｙ　Ｒ　ｅｔ　ａｌ．　Ｈｕｎｇｒｙ　ｃｏｄｏｎｓ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｉｎｇ　ｉｎ

ｈｕｍａｎ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２０１０，　３２７：　３０１［８］Ｏｊａｌａ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ．　ｔＲＮＡ　ｐｕｎｃｔｕａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ＲＮＡ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｉｎ

ｈｕｍａｎ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．　Ｎａｔｕｒｅ，　１９８１，　２９０：　４７０－４７４

Transcript mapping of mitochondrial genome and its application

Yang Yao, Yuan Huang

College of Life Science, Shanxi Normal University, Xi’an 710062, China

Abstract Mitochondrial transcript mapping is a fundamental step to study gene expression, transcriptional regulation, andgenome sequence annotation of mitochondrial genome. Several approaches including EST library sequencing, 5’ and 3’ RACE,and RT-PCR have been used to study mitochondrial transcripts for Drosophila melanogaster , Anopheles funestus , Ciona intestinalis and pig (Sus scrofa domestica). Many studies show that the mitochondrial genomes from vertebrate and invertebrateproduce 3 and 5 primary transcripts, respectively, and these transcripts are processed by tRNA punctuation model. Analysis ofthe mitochondrial transcript will provide the essential information for mitochondrial genome annotation.Key words Metazoa; mitochondrial transcripts; tRNA punctuation model; genome annotation