宏基因组学及其研究进展
宏基因组学及其研究进展
张辉,崔焕忠
(吉林农业大学动物科技学院,长春 130118)
摘要:宏基因组学是近年来发展起来的一门新兴学科,主要技术包括从环境样品中提取微生物混合基因组DNA、利用可培养的宿主菌建立宏基因组文库及筛选目的基因。该技术可以克服传统培养技术的不足,是研究未培养微生物、寻找新功能基因和开发获得新资源的重要新途径。目前宏基因组学已广泛应用于各个领域,并在医药、农业、能源开发、环境修复、生物技术、生物防御等方面有了较深入的研究。笔者对宏基因组学的主要技术方法及其应用研究进展进行了简要综述。
关键词:宏基因组学;基因组文库构建;文库筛选;研究进展
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:167127236(2010)0320087204
随着微生物学的发展,微生物基因组全序列测定计划正在全球被快速地推行,但现有技术条件下,自然界存在的可培养微生物不到总数的1%,阻碍了该计划的发展,使得绝大多数的微生物资源不能被开发和利用(贺纪正等,2008)。因此,为了研究不能培养的微生物,一个全新的理念)宏基因组学应运而生,该技术不需预先培养就能开发这些微生物基因组,目前已广泛应用于微生物活性物质的开发与利用、环境微生物种群分布及动态变化分析等方面的研究(Cowan等,2005)。1 宏基因组学的概念
宏基因组(metagenome)的概念最先是由Han2delsman等(1998)提出的,是指特定环境中全部生物遗传物质的总和,决定生物群体的生命现象。宏基因组学(metagenomics)就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。宏基因组文库既包含了可培养的又包含了不能培养的微生物基因,避开了微生物分离培养的问题,极大地扩展了微生物资源的利用空间,增加了获得新的生物活性
收稿日期:2009209227
作者简介:张辉(1973-),女,吉林人,实验师,博士,主要从事临
床兽医学研究。
物质的机会,为新的医药产业和发现新的生物技术提供丰富的基因文库,并利于环境微生物有机群体的分布和功能的研究。
2 宏基因组学的基本技术
2.1 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法,并根据具体环境样品的特点和建库目的采取了一些特殊的步骤和策略。获得高质量的总DNA是宏基因组文库构建的关键因素之一,既要尽可能地完全抽提出样品中的DNA,又要保持其较大的片段以获得完整的目的基因或基因簇。提取方法主要有2种,一种为原位裂解法,即直接将样品进行处理抽提纯化;另一种是异位裂解法,先采用物理方法将微生物细胞分离出来,然后再用较温和的方法抽提DNA。在载体方面,构建宏基因组文库目前多采用质粒(plas2mid)、细菌人工染色体(bacterialartificialchromo2some,BAC)和粘粒(cosmid)载体。质粒一般用于克隆小于10kb的DNA片段,适用于单基因的克隆与表达;粘粒(插入片段在40kb左右)和细菌人工染色体(插入片段可达350kb)已被广泛地用于大插入片段文库的构建中,以期获得由多基因簇调控的微生物活性物质完整的代谢途径(冯美琴,2008)。为了提高宏基因的表达水平便于重组克隆子活性检测,有研究者直接利用表达载体构建宏基因组文库,此外穿梭载体可扩大宿主范围而有利于外源基因的
andphylogeneticanalysis,floRgenesfrom2strainsweresequenced.Theresultsdemonstratedthatthehomologybetweentwostrainswas99.6%,whiledifferenthomology(84.8%to99.9%)withfloRgenesfromcattle2andchicken2originE.colicouldbeobtained.ThephylogeneticanalysisshowedtwofloRsequencesfromduck2originE.colipresentarelativelylowrelation2ship.ThissuggestedthatthereisnorelationshipbetweenfloRsequencesandhostsoriginofE.coli.
Keywords:duck;pathogenicE.coli;Florfenicol;floRgene;cloningandsequencing
表达。宿主菌株的选择主要考虑转化效率、重组载体在宿主细胞中的稳定性、宏基因的表达、目标性状(如抗菌)筛选等因素。研究结果表明,不同微生物种类所产生的活性物质类型有明显差异,因此可根据研究目标不同选择不同的宿主菌株,如70%的抗生素来源于放线菌,若寻找抗菌、抗肿瘤活性物质应选择链霉菌为宿主菌,而大肠杆菌则用于新型酶的筛选等(Lammle等,2007)。
2.2 宏基因组文库的筛选 目前用于宏基因组文库的筛选方法主要有基于功能筛选(fuction2based出使人们认识到利用非培养微生物进行活性物质筛选的潜能和价值,因而加快了生物活性物质开发和利用的步伐。到目前为止,所发现的抗生素的生物合成基因都是成簇排列的,因此有可能克隆到完整的次级代谢产物合成基因簇,使其在异源宿主中表达。Wang等(2000)首次以链霉菌为宿主从土壤中筛选到具有抗菌活性的5种新的小分子生物活性物质TerragineA、B、C、D、E,Terragine类为首次从环境DNA(environmentalDNA,eDNA)重组微生物产物中发现的新类型化合物。Brady等(2000)筛screeningmethod)、基于序列筛选(sequence2basedscreening)、化合物结构筛选和底物诱导基因表达筛选(substrate2inducedgeneexpressionscreeningmethod,SIGEX)。基于功能筛选是根据克隆子产生的新的生物活性进行筛选,如抗菌活性、酶活性及溶血性;基于序列筛选是根据已知相关功能基因的序列设计探针或PCR引物,通过杂交或PCR扩增筛选阳性克隆;化合物结构筛选则通过比较转入和未转入外源基因的宿主细胞或发酵液、提取液的色谱图不同进行筛选,但该方法筛选的物质未必具有活性;底物诱导基因表达筛选是利用底物诱导克隆子分解代谢基因进行筛选,这种方法可用于活性酶的筛选,现已成功应用于地下水宏基因组中芳香族碳水化合物的筛选(Uchiyama等,2005;Yun等,2005)。
3 宏基因组学的应用研究进展
3.1 发现新基因 自然界中大多数微生物物种都是未知的,从所构建的任一宏基因组文库中鉴定出的大部分基因都是新基因。因此即使是对一个相对较小的宏基因组文库进行筛选,所获得的序列与已公布的数据库中序列的相似性也很低(赵蓉等,2009)。如Tyson等(2004)对一个群落结构相对简单的嗜酸生物膜的宏基因组进行了测序,从76Mb基因中鉴定出的新基因超过4000个;Venter(2004)构建了马尾藻海(SargassoSea)的微生物群落宏基因组文库,从所测1.05@1010个碱基对中,鉴定出1.21@106
个新基因,发现1800多种新的海洋微生物,获得了大量物种多样性和丰度方面的信息,为研究海洋生命的代谢潜力和海洋生态学提供了前所未有的原始素材。利用宏基因组文库,发现的新基因主要有生物催化剂基因、抗生素抗性基因及编码转运蛋白基因等(Daniel,2005;Riesenfeld等,2004)。3.2 微生物活性物质筛选 传统的培养方法限制了生物活性物质的开发和利用,宏基因组概念的提
选出65个具有抗芽孢杆菌活性的克隆,并从中分离出一系列具有抗菌活性的长链N2酰基酪氨酸类新化合物。Brady等(2001)还筛选到一株产生蓝色色素的克隆,并从中分离到蓝色化合物Violacein,该物质具有抗菌和诱导成纤维细胞凋亡等生物活性。Gillespie等(2003)获得了2个具有广谱抗菌作用的新抗生素TurbomycinA和B及其合成酶基因簇。Lim等(2005)以枯草杆菌为宿主菌,从森林土壤筛选出具有抗菌活性和表达靛红和靛蓝的克隆子。宏基因组文库同样也是获得新的生物催化剂的丰富来源(Bornscheuer,2005)。Yun等(2004)得到一种新的淀粉水解酶(AmyM),该酶可水解可溶性淀粉、环糊精和出芽短梗孢糖,并表现出高转糖基活力,表明它是界于麦芽糖淀粉酶、A2淀粉酶和42A2葡聚糖转移酶之间的一种中间类型的新型淀粉水解酶。Kim等(2005)筛选出一种新的可能来源于土壤嗜温微生物的酯水解酶(Est25),该酶具有2.5kb的开放阅读框,由363个氨基酸组成,分子质量为38.3ku,活性中心可能为由Ser201、Asp303和His333组成的三联体。此外,Ferrer等(2005)利用K2噬菌体构建瘤胃宏基因组文库,得到22个具有水解酶活力的克隆,序列分析结果表明,其中8个是新发现的。Wexler等(2005)从废水处理场厌氧消化器获得DNA,建立宏基因组粘粒文库,筛选到一种新的醇/醛脱氢酶(adhEMeta)。许跃强等(2006)构建了造纸厂废水纸浆沉淀物的宏基因组文库,从中筛选到多个表达内/外切葡聚糖酶活性和B2葡萄糖苷酶活性的克隆,并鉴定出3个新的纤维素酶基因(um2cel5L、umcel5M和umbgl3D)。张金伟等(2006)从南极普利兹湾深海900m深的沉积物中获得宏基因组DNA并构建克隆文库,从中获得低温脂肪酶(lip3)开放阅读框的完整序列,对其进行重组表达后得到了具有活性的低温酶。Lammle等(2007)构建土壤宏基因组粘粒文库,获得12个可能编码琼脂
糖水解酶及几种可能分别编码下列酶的基因:1个立体选择酰胺酶、2个纤维素酶、1个A2淀粉酶、1个1,42A2葡聚糖分支酶、2个果胶裂解酶和2个与I型分泌系统有关的脂酶。此外,Diaz2Torres等(2003)利用人唾液分离到一种新的四环素抗性基因tet(37)。
3.3 微生物分子生态学研究 环境生物宏基因组概念的提出,使得研究者可能绕过细菌分离培养这一步骤,而从基因水平进行微生物分子生态学的研究。从环境中提取DNA,再通过PCR等方法获得解有机合成卤素的能力。环境微生物中具有大量的未知的脱卤素序列片段,利用宏基因组方法可以筛选出具有降解能力的目的克隆,达到清除有毒污染物以净化环境的目的(Galvao等,2005)。此外,某些细菌具有固定污染水中的重金属能力。随着对环境细菌宏基因组研究的不断深入,人类可获得大量的降解基因,通过遗传工程的方法,设计新的代谢途径,构建出具有多降解基因的工程菌,这将对治理环境污染的生物修复有着重大的意义。4 结语
各种细菌rDNA,测序后进行系统学分析,即可描述环境微生物的遗传多样性,使人们对大量不可培养的微生物群体有了全新的认识(叶姜瑜等,2005)。方光伟等(2005)从土壤宏基因组中筛选到不动杆菌属细菌基因序列,该研究为分析土壤环境种群结构奠定了基础。Goodman采用BAC载体,构建不同土壤细菌宏基因组文库。通过16SrRNA基因序列的系统发生学分析结果表明,文库DNA包含许多种不同分类的新微生物,如Acidobacteri2um、Cytophagales和Proteobacteria等,提示环境微生物具有极其广泛的多样性。Rodriguez2Brito等(2006)分析了10个新的分枝杆菌噬菌体,并推断全世界获得的噬菌体宏基因组还不到总量的0.0002%,表明噬菌体的生物多样性。宏基因组扩大了生态学研究的对象,随着分子生物学技术的发展,以功能基因为基础的功能生态学将成为今后研究的方向。
3.4 生物降解作用研究 随着工业的快速发展及人类对资源的大量开发和利用,给环境带来了严重的污染问题,微生物是适应环境能力最强的物种,探索污染环境微生物适应性及其获得适应性的途径,可以更好地揭示生物与环境之间的生态学意义,为污染环境的生物修复提供理论依据。利用微生物的生物修复潜能解决环境污染问题是目前环境治理的一个重要研究方向(张作良等,2005)。细菌可能通过改变启动子结构或激活启动子之间不活泼的核心序列来参与专一性底物降解过程,或通过抑制非必需因子及较强蛋白质分子的精细调节作用来降解异型生物复合物。研究结果表明,某些细菌对有机污染物具有生物矿化作用,Janssen等(2005)发现细菌的脱卤素反应可催化碳卤结合物的分裂,而碳卤结合物的分裂是环境污染物)卤素化合物需氧矿化的关键一步,采用基因突变使细菌沉默的基因发挥催化功能或使其作用的底物范围改变,而增强细菌分
从环境宏基因组中获得功能基因,不仅可以用于新药的研发,而且在新的工业用酶等生物活性物质的筛选及在解决环境污染的生物修复等问题方面都具有广阔的前景,是基因工程研究的一个主要方向。目前,运用宏基因组技术对海洋病毒已有较深入的研究(Culley等,2006;Delwart,2007),而对土壤病毒所开展的研究还很少。构建环境cDNA文库,促进真菌资源的开发应用研究,也将是宏基因组学的主要研究内容之一。尽管目前存在表达的外源基因量少、缺乏高效的筛选方法等不足,但是随着新的科技方法的不断发展,应用范围将会越来越广泛。
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isolationDNAfromenvironmentdirectly,genelibraryconstructionandscreeningoftargetgeneclone.Metagenomicscanover2cometheshortagesoftraditionalculturingmethodsanditisanimportantnewwaytostudynon2culturablemicrobes,tofindnewfunctionalgenes,andtoaccessnew.Inrecentyears,metagenomicshasbeenwidelyappliedinmanyfieldsandin2deepre2
searchwasconductedinmedicine,agriculture,energydevelopment,environmentalrestoration,bio2technology,bio2defense,andsoon.Thearticlereviewedthemaintechniquesandresearchprogressofmetagenomicsbriefly.
Keywords:metagenomics;libraryconstrucion;libraryscreening;researchprogress