微生物发酵法生产谷胱甘肽
无锡轻工大学学报第23卷第5期Vol. 23 No. 5
2004年9月Sep. 2004Journal of Wuxi U niversity of Light Industry
文章编号:10092038X (2004) 0520104207
微生物发酵法生产谷胱甘肽
陈坚, 卫功元3, 李寅, 堵国成
(江南大学工业生物技术教育部重点实验室, 江苏无锡214036)
摘 要:谷胱甘肽是一种重要的生理活性肽类物质, 对于维持生物体内合适的氧化还原环境起着
关键作用, 在临床医药、. 甘肽生产的主要方法. 行了简单展望.
关键词:; ; ; 中图分类号:7文献标识码:A
Progress in G lutathione Production by Microbial Fermentation
CHEN Jian , WEI G ong 2yuan 3, L I Y in , DU Guo 2cheng
(K ey Laboratory of Industrial Biotechnology , Ministry of Education , S outhern Y angtze University , Wuxi 214036, Chi 2na )
Abstract :G lutathione (γ2glutamylcysteinylglycine , GSH is the reduced form ) , the most ubiquitous low molecular weight non 2protein thiol compound , is widely distributed in almost all the aerobic organisms. Being one of the important physiological active peptides , GSH plays many physiological functions in the cells , for instance , maintenance of normal redox potential in the cells , radical scavenger , detoxification of various cytotoxic compounds , antioxidant , and so on. As glutathione has wide application potential in medicine , food , athletic sports and so on , the commercial demand for GSH has been expanding. The main technique for GSH preparation at present is by biotechnological method , which comprises enzymatic transformation and microbial fermentation. In this article , GSH production by fermentative approach within the recent 30years was reviewed. The screening of strains for high GSH production , optimization and control of the bioprocess , and the application potential of genetic bacterium for GSH overproduction by fermentation were described
in detail. In the end , the problems to be solved and the foreground for biotechnological production of GSH were briefly prospected.
K ey w ords :glutathione ; fermentation ; production ; progress
谷胱甘肽是由L 2谷氨酸、L 2半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的一种同时含有γ2谷氨酰基和巯基的生
收稿日期:2003212224; 修回日期:2004205218.
物活性三肽化合物. GSH 在生物体内具有多种重要
的生理功能, 特别是对于维持生物体内适宜的氧化
基金项目:江苏省高校高新技术产业发展项目(编号:JH022101) ; 高等学校优秀青年教师教学科研奖励计划资助课题.
作者简介:陈坚(19622) , 男, 江苏无锡人, 教授, 博士生导师; 3现在工作单位:苏州大学生命科学学院.
第5期陈坚等:
微生物发酵法生产谷胱甘肽105
还原环境起着至关重要的作用[1], 在临床医药、食品工业、体育运动及有关生物研究领域有着广泛的用途. GSH 可以在短期内迅速提高机体的免疫力, 因此其需求量和市场价格日趋见涨.
自20世纪60年代起, 日本学者就在生物法生产GSH 方面进行了大量研究, 申请并公布了一系列相关的专利[2]. 生物法现已成为GSH 生产的主要方法, 包括酶法和发酵法, 二者最主要的区别在于酶法需要提供3种底物氨基酸和价格昂贵的A TP , 而发酵法只要供给微生物生长代谢所需的营养物质(碳源、氮源和无机盐等) 即可实现GSH 在胞内的积累. 国内已有学者对GSH 的性质、应用及生产方法作过简单综述[3~5], 法生产GSH 发酵过程的基础和出发点. 30年来国内外在微生物发酵法生产GSH 方面的研究进展.
利用微生物自身的物质代谢来进行GSH 生物合成的方法. 一般情况下, 微生物细胞中GSH 的含量不高(仅为干重质量分数的0. 5%~1. 0%) , 这无疑大大提高了实际生产中GSH 的提取成本. 因此, 发酵法生产GSH 的最关键问题在于提高微生物体内的GSH 含量, 通常是通过菌种选育来实现, 主要有两
种方法:一是采用常规诱变育种选育高产菌株, 二是利用遗传工程技术构建具有GSH 合成活性的基因工程菌. 由于发酵法所使用的细菌或酵母容易培养, , 因此工业化生产的30GSH 的研了总结. 可以看出, 酵母一直是研究的首选, 其中以酿酒酵母最为常见, 相关的文献报道也最多. 酿酒酵母细胞中GSH 的合成及分解代谢过程已被研究清楚, 主要是通过细胞内的γ2谷氨酰循环进行代谢的, 具体过程见图1[6].
1 概 述
发酵法生产GSH 就是采用廉价的糖类原料,
表1 微生物直接发酵生产谷胱甘肽及其工艺条件
T ab. 1 An overview of the fermentative conditions of glutathione production by microorganisms 菌种
Candida t ropicalis Candida utilis
碳源
glucose molasses glucose glucose glucose glucose glucose glucose glucose
氮源
(NH 4) 2SO 4urea , NH 4H 2PO 4
(NH 4) 2SO 4(NH 4) 2SO 4(NH 4) 2HPO 4(NH 4) 2SO 4(NH 4) 2SO 4(NH 4) 2HPO 4(NH 4) 2SO 4(NH 4) 2SO 4urea
urea , (NH 4) 2SO 4(NH 4) 2SO 4, NH 4H 2PO 4(NH 4) 2SO 4, NH 4H 2PO 4
urea , (NH 4) 2SO 4(NH 4) 2SO 4, NH 4H 2PO 4
(NH 4) 2SO 4
(NH 4) 2SO 4(NH 4) 2SO 4peptone (NH 4) 2SO 4peptone (NH 4) 2HPO 4
温度/℃时间/h
[***********][***********]3030303130
9614242815-[***********]607. [1**********]25
GSH 360mg/L 0. 733%4. 0%5. 0%3. 0%510mg/L 2. 4%74mg/L 366mg/L 3. 5%432mg/L 4. 0%2. 47%475mg/L 2. 7g/L 3. 7%300mg/L 119mg/L 116mg/L 185mg/L 1. 82%180mg/L 880mg/L
规格摇瓶100mL 200L 200L 70L 15L 摇瓶摇瓶7L 摇瓶125L 摇瓶2L 2L -120m 3L
3
参考文献
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酵
S accharomyces cerevisiae glucose glucose molasses molasses molasses molasses molasses glucose glucose
母
玉米浆
S accharomyces sp. sucrose Methylomonas methanolvorens methanol 细
Proteus mirabilis glucose
菌
E. coli glucose
Saccharomyces cystinovolens
摇瓶摇瓶25L 2L 1L
注:3GSH 的合成以产量(mg/L ) 或质量分数(对细胞干重的百分比, %) 表示.
106无 锡 轻 工 大 学 学 报 第23卷
图1 酿酒酵母细胞中谷胱甘肽的代谢途径
Fig. 1 Metabolism pathw ay of glutathione in cells of Saccharomyces cerevisiae
2 高产菌株的选育
虽然有些菌株如S. cysti novolens , C. t ropi 2
calis 等本身有较高的GSH 含量且可以长时间保持
化钠、亚硫酸盐、酰胺和靛酚等. 通过一系列对菌株的
改良及选育工作, 获得了很多GSH 高产菌株.
C. utilis 和S. cerevisiae 是工业生产常用的菌种, 因此针对这两种酵母进行的菌种选育研究工作也最为广泛. 国内外已有许多相关的文献报道, 其中对诱变效果较为显著的方法和结果进行了简单总结(见图2) . 除此之外, 细胞原生质体融合技术的运用也可以获得GSH 的高产菌株. 刘娟等利用该技术, 将生物量高的酵母菌单倍体与细胞GSH 含量高的单倍体进行融合,
构建获得了高产GSH 的融合菌株Z J F 271, 在优化的发酵条件下进行摇瓶培养, 发酵液中GSH 质量浓度总量可以达到185mg/L [26]. 这一方法的成功实施, 为常规诱变育种拓展了新的思路.
合成GSH 的能力, 但是它们并非工业化常用菌种, 研究成果也只局限于摇瓶中的结果. 普通的野生型酵母细胞中GSH 的含量并不高, 只有采用物理的或化学的方法使出发菌株发生变异, 再在特定的培养基中进行筛选培养, 使GSH 在这种变异菌株的细胞内大量积累, 以此实现GSH 的高产. 到目前为止, 针对GSH 生产的酵母菌株而进行的物理或化学
γ射线以及亚硝的处理方法大致有紫外线、X 射线、
基胍等, 而培养基中的特定筛选物质(筛子) 主要包括蛋氨酸、L 2乙硫氨酸、DL 2乙硫氨酸、1, 2, 42三唑、氰
图2 高产G SH 酵母菌株的选育方法和结果
Fig. 2 Approaches and results of yeast strains screening for high G SH
production
第5期陈坚等:微生物发酵法生产谷胱甘肽107
3 发酵过程的优化及控制
在实际的发酵生产中, 性能优良的菌种仅仅是一个开始, 获得较高的产物质量浓度(便于下游处理) 、较高的底物转化率(降低原料成本) 和较高的生产强度(缩短发酵周期) , 同样是实现GSH 工业化生产所需要解决的关键问题[31], 因此对GSH 发酵过程进行优化控制就显得尤为重要. 这方面的研究大都是从20世纪90年代以后开始的, 主要包括营养与环境条件优化、发酵过程控制以及前体物质的添加等内容. 3. 1 发酵条件优化
生产GSH 往很低. 因此, , 行优化, 在最佳的工艺条件下进行生产, 为最终的工业化生产奠定基础. 运用一些实验设计(如正交试验设计、因次分析设计、中心复合试验设计等) 及数据处理方法(响应面分析、神经网络模型等) 可以减少工作量并且使实验结果具有更高的可信度和实际应用价值. Udeh 等采用中心复合试验设计方法对发酵培养基中的主要成分进行优化, 结果与优化前的情况相比提高近一倍[32]. Liu 等采用Box 2Behnken 设计方案和响应面模型研究了葡萄糖、蛋白胨和MgSO 4质量浓度对S. cerevisiae 生产GSH 的影响, 也取得了令人满意的结果[33]. 作者根据正交试验获得的实验数据, 通过神经网络模型进行分析预测, 对C. utilis 发酵生产GSH 的培养基进行了优化, 摇瓶条件下GSH 胞内质量分数达2. 35%, GSH 产量和细胞干重也有较大幅度的提高[34].
设法提高细胞数, 以提高GSH 的总产量. 为了实现这一目标, 必须加大底物(如葡萄糖) 的质量浓度. 但是过高的葡萄糖质量浓度会产生Crabtree 效应, 抑制细胞的生长并且目标产物得率会大大下降, 因此需要采用流加培养方式, 应用比较普遍的通常有恒速流加、指数流加和反馈控制流加等模式. 采用流加发酵实现GSH 生产菌株的高密度培养以进一步提高GSH 产量, 国内外已有相关的报道. Shimizu 等[38]以葡萄糖作为限制性底物, 研究了S. cere 2visiae 培养中比生长速率μ和GSH 生产强度ρG 之间的关系. , 通过指数流加; 在GSH 合成, , 从而控制比生长速率处在临界水平. 按照以上方案对细胞生长进行控制, 结果发现, 最终GSH 总量比对照提高了41%, 胞内GSH 含量也有很大提高. Sakato 等[22]通过在线监测发酵液中溶解氧和乙醇的体积分数, 运用前馈/反馈控制系统确定葡萄糖的流加速率, 使葡萄糖和乙醇同时被利用. 发酵结束时GSH 产量为2360mg/L , 比指数流加方式提高了40%, 胞内GSH 质量分数达到3. 7%.Alfafara 等[22]通过对发酵过程中乙醇产生的速度进行模糊逻辑控制, 进而优化了S. cerevisi 2
ae 生产GSH 的流加发酵过程, GSH 的比生产速率
达到6. 2(mg/g ) /h , 最终发酵水平提高了56%.陈坚等[39]和李寅等[40]比较了恒速流加、人工反馈控制流加和指数流加等3种补糖策略对重组大肠杆菌高密度培养合成GSH 的影响, 发现指数流加的方式最为理想. 3. 3 前体物质的添加
在GSH 发酵过程中, 可以向培养基中添加除营养物之外的物质, 以提高GSH 在胞内的积累量. 研究结果显示, 添加L 2谷氨酸、L 2半胱氨酸和甘氨酸及其混合物能提高细胞内GSH 的含量, 其中以添加L 2半胱氨酸的效果最为显著. Alfafara 等考察了S. cerevisiae 摇瓶发酵生产GSH
过程中3种组成氨基酸对GSH 合成的影响, 结果表明,L 2半胱氨酸是提高GSH 比合成速率及GSH 产量的关键氨基酸, 但超过一定的量范围会对细胞生长有部分抑制作用[41]. 原因可能是由于糖代谢过程中一些酶的活性中心离子与过量的L 2半胱氨酸发生螯合作用而使这些关键酶降低或失去了活性. 因此, 在发酵过程中应采用L 2半胱氨酸的补加策略以尽可能减少其对细胞生长的抑制. 为此,Alfafara 等进一步研究了流加培养中用以提高GSH 比合成速率的一种快
另外, 发酵培养的环境条件也是不可忽视的重
要因素, 影响细胞生长以及合成GSH 的环境因素主要有温度、p H 、溶解氧和接种量等. 温度直接影响着代谢中各种酶的活性和生化反应速率;p H 决定营养物的解离状态, 制约着微生物细胞对营养物质的吸收利用速率; 溶氧的大小控制着细胞对氧的需求; 而接种量的大小则影响迟滞期的长短以及细胞倍增繁殖的速度. 因此, 在营养条件确定的基础上, 对环境因素的优化也是必不可少的. 研究结果表明, 较佳的环境条件对GSH 合成都有较明显的促进作用[35~37]. 3. 2 发酵过程控制
由于GSH 是胞内产物, 所以在提高生产菌株胞内合成GSH 能力的同时, 还需要在发酵过程中
虑菌株所带质粒的稳定性问题, 而质粒的稳定性受到宿主细胞遗传特性、质粒拷贝数以及质粒上基因的表达等多种因素的影响. 为此, 李华钟等以野生型E. coli 为宿主细胞, 转化带有编码GSH 合成酶系的基因gsh Ⅰ和gsh Ⅱ的质粒p GH501, 获得了一株GSH 合成活性、质粒稳定性和传代稳定性俱佳,
并且能够重复使用的重组大肠杆菌E. coli Ⅱ21, 经过甲苯处理后的菌株可以在胞外积累4g/L 左右的GSH , 通过L 2丝氨酸2硼酸钾混合物的添加防止了GSH 的进一步降解, GSH 产量可高达7. 1g/[49]. 速添加半胱氨酸的策略, 并利用此策略来最大限度提高GSH 的总产量[42]. 李寅等在摇瓶培养中考察了前体氨基酸和A TP 的添加对重组E. coli 生产GSH 的影响, 发现二者均能明显促进GSH 在细胞
内的积累[43]. 当9mmol/L 的前体氨基酸在发酵进行到12h 时加入, 可以获得比对照实验多40%的GSH 总量, 胞内GSH 含量也提高了将近1倍[35].
4 基因工程菌在谷胱甘肽生产中的
应用
在GSH 的生物合成中, GSH 合成酶系的活性普遍较低, 并且GS H Ⅰ是一个限速酶, GSH 的反馈抑制. 因此, GS H , .
的反馈抑制, GSH 的敏感性[44]有关GSH 的研究报道非常多, 但绝大部分都是GSH 在生物体内生理功能的体现及其在疾病治疗过程中的应用等内容. 如何提高GSH 的产量并且在最大程度上发挥出发菌株生产GSH 的潜力, 相关的文献资料则寥寥无几, 而这些研究成果正是保证GSH 工业化生产持续、稳定、高效运行的理论依据和技术支持. 虽然目前日本已经实现了酵母发酵法制备GSH 的产业化, 并且也将研究结果以专利的形式公布于众, 但是总体来说, 对整个GSH 发酵过程的把握和分析还相对肤浅, 对GSH 产量、生产效率和生产强度等主要技术指标的影响因素的探讨还不够透彻. 因此, 至少有以下几个方面的问题值得我们去进行更为深入地研究. (1) 性能良好的GSH 高产菌株的选育及其培养条件的优化; (2) 环境条件(温度、p H 、溶氧等) 对GSH 生产的影响及其发酵动力学规律; (3) C. utilis 生产GSH 发酵机理的分析及基于代谢工程理论的合理解释; (4) GSH 生产菌株高密度培养过程中各种关键因素(如CO 2抑制和O 2供给等) 的解决; (5) 如何将胞内合成
有较强GSH E. coli 并从E. coli B 中筛选得到一株GS H Ⅰ脱敏突变株, 克隆了其
gsh Ⅰ基因并在E. coli B RC912中得以表达, 获得
的菌株合成GSH 的能力大大提高[45]. GS H Ⅰ的活性提高以后, GS H Ⅱ就成了GSH 生物合成的限速酶. Gushima 等构建了含gsh Ⅰ或gsh Ⅱ的重组质粒并转化入E. coli 细胞, 结果表明只有同时带有gsh Ⅰ和gsh Ⅱ基因的重组细胞才表现出最高的GSH 合成活性[46].
由于酵母菌中的糖降解酶活性较高, 因此可以将gsh Ⅰ和(或) gsh Ⅱ基因转化进入酵母细胞内以获得高产GSH 的重组菌株. Ohtake 等尝试在酵母中表达E. coli B 的gsh Ⅰ基因, 将gsh Ⅰ基因的全部编码片段与S. cerevisiae 98的一个启动子融合, 结果转化体的GS H Ⅰ活性和GSH 的胞内含量分别提高了100多倍和3倍多[47]. Christine 和Ulf 将含有E. coli 中gsh Ⅰ和gsh Ⅱ基因的质粒p IN E Ⅲ转化到S. cerevisiae 中, 明显提高了酵母合成GSH 的能力, GSH 在胞内的积累质量分数达到1. 8%[48].
的GSH 分泌至胞外, 解决胞内GSH 高积累产生的反馈抑制, 也是值得深入研究的热点课题之一.
在基因工程菌生产目的产物的过程中, 必须考
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(责任编辑:杨勇)