现代科技方法在功能化妆品中的应用

现代科学技术方法在功能化妆品中的应用

刘铮，刘平、叶小蓉、刘毅

（北京大学医学部，医力健生物科技公司，耐确生化技术研究所，100191，北京）摘要：功能化妆品属于边缘学科，它是得益于当今生物化学、生理学、药学、皮肤学、药理学、细胞生物学、化学工程学、现代分析仪器等相关学科的科研成果来成长和构建自身。本文着重阐述现代科技方法在功能化妆品研发中的应用。

关键词：功能化妆品；现代科学技术方法；应用

功能化妆品属于边缘学科，它是得益于当今生物化学、生理学、药学、皮肤学、药理学、细胞生物学、化学工程学、现代分析仪器等相关学科的科研成果来成长和构建自身。现代科学技术方法，在功能化妆品中的应用，如皮肤生理学现代技术的突破，以及激光扫描共焦显微技术，皮肤体外筛选试验技术，都大大推进了功能化妆品的发展，使功能化妆品更加具有市场价值。不断提高功能化妆品的质量，让功能化妆品日益成为人们生活的必需品。

功能化妆品毕竟不是外用药。外用药是有针对性地用于出现急性或慢性病变的皮肤, ，如皮肤出现白癜风（牛皮癣）, 采用外用药补骨脂之类的搽剂，但补骨脂在功能化妆品是禁用品，因为它能招致皮肤光敏性反应（photosensitive reaction ），有害人体皮肤。当出现手癣或脚癣时，采用抗真菌膏霜或洗剂，如抗真菌的酮康唑之类，但是，其通过皮肤吸收，会损害肝脏。当手癣或脚癣得到控制康复后，就停止用药。因此，外用药强调的是对症下药，事后处理。康复后不可也不必要长期使用，因为人体长期使用外用药，会出现剂量过大，属于滥用，对不同人体会造成不同程度的副作用或损害。而功能化妆品对皮肤强调的是：提早预防皮肤问题，事前护理，是以延缓肌肤衰老和护理肌肤为前提，不完全是等肌肤出现了问题才开始使用。功能化妆品对人体毕竟比外用药要安全得多，可以长期使用。通过长期使用才能体现护肤的功能价值。比如：目前美容市场上的高档祛斑产品，严格地说，应该是抑制新的酪氨酸酶活性，降低新的色斑生成速度，也就是说事前预防新色斑的异常增生，对已形成色斑的淡化或消除，不是用了祛斑霜的功劳，应该是通过体内正常生理的新陈代谢来完成的。总之，功能化妆品不是外用药，所以，也不能采用管理药品的法规标准来衡量管理功能化妆品。功能化妆品作为长期使用皮肤护理品，更应该是以安全为圆点，以功能为半径，这

样不偏离安全性的圆圈，功能的半径越长，圆圈就越大，消费者使用后就越受益。以下着重阐述现代科技方法在功能化妆品研发中的应用：

1、激光扫描聚焦显微镜（Laserscanning confocal microscopy, LSCM）是当今世界上最先进的分子细胞生物学分析仪器之一。它是在普通荧光镜成像基础上，加装了激光扫描装置，并利用计算机的图像处理技术，使用紫外或可见激光激发荧光探针，从而得到的细胞或组织内部细微结构的荧光图像。它能产生真正具有三维清晰度的图像，同时可在亚细胞水平上观察诸如钙离子，pH值和膜电位等生理信号，以及细胞形态的实时动态变化，成为形态学，分子细胞生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。近几年来，LSCM这种先进的检测手段被引入功能化妆品研究领域，并取得了有价值的研究成果。为功能化妆品美化人们皮肤的现代化研究创造了有利的条件。如Boderke 等[1]采用LSCM 技术，研究氨基多肽酶在人体表皮活性的分布情况。Vardaxis 等[2]用LSCM 技术测试猪皮的结构，得到非常有价值的组织形态学信息。为了研究治愈伤口，Simonetti 等[3]应用LSCM 技术方法，观察了体外重组活性成分在表皮角质层扩散的通道。Lademann[4]报道了：LSCM体内法测定非常适应于研究皮肤结构和局部应用功能活性成份在皮肤的渗透过程。LSCM这种非侵入性体内方法在临床诊断和皮肤治疗控制方面，成为非常有效的工具。借助LSCM 方法，分析外用活性物在皮肤上分布，可以优化功能化妆品活性物在皮肤生理学参数和利用度。

2、系列生物测试方法

（1）皮肤测试skin test

Tagami 等发表的有关体内和体外角质层保水量测定的综述

*角质层的水保留体积

*角质层水含量的测量

*高频气流对皮肤表面水合状态的体内评估

*体内水吸附-解吸附试验

*应用试剂的总体作用评估

*角质层的防水和储水功能间的相互关系

*角质层的保湿物质

*皮肤水分评估的体外快速试验

*角质层表面和深层次的水含量体积[5]，内容包括：

皮肤水含量测定：Dorogi对皮肤水含量的仪器测定法，进行了总结[6]。保湿的效果，可以借助皮肤表面形态和触觉性质改变，以及粘弹性，电介质磁化系数，红外吸收率，可见光折射和散射，及其他技术，进行测定。虽然使用仪器，容易获得这些类型测量，但是Dorogi 提醒这些数据的分析和解释，需要考虑物理和物理复合物的问题。

核磁共振技术（NMR）研究含水量：Vavasour等报道了使用核磁技术研究豚鼠角质层的水分含量[7]。

在角质层（SC）的生理学和病理学状态下，有关水的作用还不大清楚。尽管类似于“水合作用，水化剂，软化剂和干性皮肤”等术语已经被广泛使用，实际上这些有关角质层水含量的每一个关系，都还不清楚。特别是，角质层的各个腔隙间的水定位还很模糊，水在屏障功能中，可能发挥的作用也不清楚。

另一方面，有相当数量的文献报道研究角质层水分所使用的技术，例如电荷测量，红外线分光镜检查，微波传递，导热系数，光声光谱学，粘弹性能，荧光染色，局部解剖，电子探头分析和核磁共振（NMR）法。

Vavasour 等认为核磁共振技术有非破坏性技术的优点，它可以检查原组织，而无须模型或者广泛的样品标本。他们的研究结果显示，大量的水与角质层的角化细胞紧密交互影响，相比较细胞间的水含量是微量的。他们还进一步推测，水分在细胞间角化细胞蛋白（角蛋白）的存在形式，是凝胶状结构，而且这种结构作为水的扩充被增加。

核磁共振成像技术测量水含量：Fanconi等已经提出了一种测量表皮水含量的核磁共振成像技术（MRI）[8]。已有大量的方法被提议用以评估皮肤的水分含量。这种体内非侵入的技术方法，普遍存在较低空间分辨力的不足，这样就不能在表皮，真皮和皮下组织间，提供良好分辨力。

自1980年以来，核磁共振成像技术就用来作为诊断工具，因为它非侵入破坏的特性，现在已常被采用。对比不同组织所提供的重要参数，是弛豫时间（T1和T2）以及质子密度。他们能被用以测量局部区域，且与流动水内容物相关。与纵向弛豫时间（T1）相比，横向弛豫时间（T2）是一个流动水量改变的更灵敏的标示剂。

在研究中，调研者通过高分辨率的核磁共振成像技术，使用横向弛豫时间测定，来定量流动含水量。他们的研究确定每日应用一种皮肤保湿乳膏剂，可以增加水含量。这种技术，对于常规使用仍然很昂贵，但是也是一种着眼于未来的方法。

保湿量的快速非侵入性试验：Serup发表了一种测量水合，缩合以及皮肤表面脂质化的快速试验法[9]。试验性材料被应用于前臂的屈肌侧，3个小时后采用非侵入性技术测量。以电传导和电容，作为表皮水合作用的指示剂。扫描D-Squame a ，测定光通量。

含不同程度聚集尿素的乳剂，能用统一的方法，来划分等级。10%尿素的乳剂比3%尿素的乳剂，或者对照载体的湿润性更好。还发现尿素是一种非常有潜力的除垢剂，尤其是10%的浓度时。

结果显示3小时的快速试验方法，对于划分保水乳剂的保湿功效的等级，非常有效。使用的这一方法学，显示高度的重复性。

测量水分扩散的蒸发剂：Norlen等描述了一种新的基于计算机的蒸发仪系统，可用于快速精确测量角质层的水分扩散[10]。

当评价不同试剂的屏障-干扰效应和不同反应的闭合作用时，有可靠的方法评价皮肤屏障功能，是非常重要的。最简单也是最直接的一种评价屏障功能的方法，就是利用蒸发计的技术，测量体内不敏感的排汗。然而，透表皮水分丢失（TEWL）的测量受周围环境相对湿度、温度的影响，还受皮肤疼痛过程及心理状况等项目，和其他造成方法存在低精密度的因素的影响[6]。因此，为了使这个简单而且快速的方法，具有一些真实的价值，这些外部条件必须仔细控制和标准化。

为了解释这些障碍，Norlen等已经构建了一个封闭的体外系统，来测量透过离体的角质层的水分扩散速度。在他们的系统中，相对湿度和温度能保持恒定，而且在稳定状态下，数据能持续收集。

这些研究者认为，与体内透表皮水分丢失（TEWL）的测量法相比，基于体外系统透表皮水分丢失（TEWL）测量法的精密度，要高出三倍。他们的研究结果表明如下：

*角化细胞的外膜对角质层的屏障能力有贡献率。

*切除脂质细胞间基质将使水分透过角质层的扩散速率，增加大约三倍，并没有像先前预测的那样增加100倍。

*十二烷基磺酸钠（SDS）溶解在水中，既没有改变水的扩散速度，也不能改变角化层保水能力。（最近对十二烷基磺酸钠（SDS）的研究引人注目，因为这些研究使我们相信，清洁剂危害皮肤保障层，将引起透表皮水分丢失（TEWL）的增加，并使皮肤更加容易受刺激）。

非侵入性技术评价光损害：Quanert等论述了一种新的体内非侵入性技术，辨别人类皮肤的光损害和老化[11]。在治疗慢性光损害时，我们必须要区分是由于光照造成的皮肤损伤，

还是由于本能的老化过程中出现的皮肤改变。作者使用仪器技术，来区分一系列由于老化出现的皮肤性质的改变，和那些因为光照损伤引起的变化，特别是有关弹性方面的性质。

对一组年轻人和一组老年者的不同程度暴露在阳光下的三个部位。用一种脉冲扫描的超频率音响系统，来测量皮肤的厚度；采用一种单轴的变形测定器，评估弹性的性质。使用硅树脂摩擦印痕和一种金刚钻表面光度计,测定皮肤表面粗糙程度。结果显示：年轻人和老年者每个部位的皮肤粗糙程度,都有明显的不同。结果还显示太阳下曝晒和防护部位的区别仅在老年组存在。皮肤弹性方面的参量在两组之间有差别，而且也在太阳暴露下的不同部位间显示了最大的差别。单轴的变形测定器能，够测定主要因为光照损伤引起的皮肤弹性的丧失，而且皮肤表面主要随年龄的增长而显示粗糙程度增加，但是利用横向弛豫时间（T2）的测量，来量化表皮流动水含量，并发现粗糙程度也有适当的减少。他们的研究确认，日常应用皮肤湿润软膏剂，能增加了皮肤的保水量。

角质层的细胞保护层：Schatzlein 等使用高分辨率聚焦激光扫描，来揭示有关角质层非统一的细胞保护层，和完整皮肤的渗透性屏障功能的新知识[12]。

针对超变形脂质水疱，开发了一种新型的功能性的皮肤荧光染色技术。这种合并了聚焦激光扫描显微镜技术的染色方法，可以揭示完整皮肤，大于或者等于0.2微米厚度的结构学和屏障功能特点，这已经是到光学显微镜的极限了。

渗入角质层的不同通道显示出：被揭示的皮肤解剖和屏障功能的新细节。最突出的是：角质层的侧向非均一性，在此还发现三到十个相邻的角化细胞，排列成一簇。每簇角质细胞边缘内广泛相互插入，但是相邻的簇之间被一些微米厚的障碍物所分离；而且在簇与簇之间的区域内，脂质保护层也很少有规则而紧密。

在角质层发现数量上有两条不同的亲水通道：一条是两角化细胞簇之间，另一条在两角化细胞之间。簇之间的亲水通道有较低的渗透阻力，面积最多占总皮肤的1%或者皮肤亲水通道面积的20%。角化细胞间的亲水通道的渗透阻力大一些，而且所占面积也广一些，占有至少3%的总皮肤或者80%的皮肤亲水通道面积。后者亲水通道十分弯曲，因为它在一簇的所有角质细胞间进行。它处于细胞间的脂质层和/或者相邻角化细胞膜（实际上能充当皮肤中的吸水途径）之间，其途径不规则。可以推断这样的通道与水分透过皮肤蒸发的路径，是相一致的，并展示了与角化层连接的最大渗透性障碍。

水合作用的核磁共振成像（MRI）显微镜观察：Szayna等论述了采用高分辨核磁共振成像技术（MRI）和核磁共振（MRI）显微镜方法,对美容护理产品，进行体内法和体外法水合作用研究[13]。

采用体内法和体外法测定，提供了人类皮肤和皮肤样品的数据。在体内测量法中，使用了三维核磁系统对三位女性志愿者的前臂观察发现，在前臂使用了护肤霜之后，信号强度增加了30-58%，因护肤霜类型而不同。平面的分辨率为90微米，薄片的厚度是2毫米。

体外化学选择性变化的缩微图像研究，采用人类腹部皮肤样品，使用9.4-T 的分光光度计。在这些试验中，平面分辨率为4微米,薄片的厚度为100微米。

结果清楚地解释了美容护理产品，在角质层有湿润功效。这些作用能用体外试验辨别验证。不允许乳剂的脂质成分进入皮肤，也能在体外观察到。皮肤如果闭塞，因此较长时间保持湿润的作用，无论如何不会排除在外。

这些结果证实了核磁共振成像技术（MRI）体内和体外研究人类皮肤，以及紧接着的美容-护理产品和药理学油膏，影响皮肤渗透性的能力。

超声波研究：Diridollou等已经公布了一种使用超声波在体内测量皮肤机理性质的方法[14]。在这项研究中，他们报道了一种叫“echorheometer”的新的独创仪器。该仪器是一个带有超声波扫描（A-模式，TM-模式和B-模式）的泵系统，能同时呈现和测量体内皮肤结构的变形情况。

伴随扫描仪在这里的描述，使用强聚焦的宽波段，20兆赫兹中央频率传感器可以获得高分辨率，轴向分辨率可达0.07毫米。这个设备可以非破坏性测定的不仅包括那些变形的皮肤结构，还有他们的形态变异和包括应用不同压力程度的区域。

使用这个扫描仪测定十位志愿者的手前臂，研究了抽吸时真皮和皮下脂肪的行为。结果显示应用的垂直应力的阻力，主要来自真皮，而不是皮下脂肪。此外，抽吸时有一定数量的流体渗入组织。结果还显示，真皮对抽吸时的反应最初是由于它的自然压力，随着变形的日渐增加，真皮本能性的弹性，对张力性阻力有着越来越大的影响。

根据这些信息，作者希望开发一个机理模型来定义皮肤适当的机理参数。这将允许真皮评估中的变化，并能对治疗性的影响进行评估。但进一步说，还不能应用于皮肤老化研究和软化，水合以及其他化妆品功效指标的评定。

计算机辅助图像分析：Murphy等描述了一种皮肤表面再生的计算机辅助图像分析程序

[15]。他们使用一种基于橡皮的牙齿压痕印材料，来准备负面表面压痕。其电子显微图，采用低放大率和程序性的计算机辅助图像分析仪，定量研究代表部位的形态学特点。

皮肤光泽度测量：Chommeloux描述了一种便携式测试仪器测量人类皮肤的光泽度[16]。最近的研究显示了，该仪器测定光泽度分两种：一是通过角质层的光线反射，二是通过已经渗入真皮经过吸收和散射后再反射的光线。

Chommeloux 使用的仪器测量两个反射信号，来评定人类皮肤的光泽度。不同光泽和相同颜色的三个基础测量操作，显示该仪器能够分辨化妆品引起的散射光。而且也提供了良好的视觉一致性。

这项技术能够评估不同产品在前额油性皮肤条件下，消除光泽外表的功效。它也能够辨别应用于脸部两种类型美容霜，所产生的不同光泽度。

机器人触摸探测皮肤粗糙度：Sasai报道了一种机器人手指（载有新开发的触觉震动传感器和位移传感器）探测皮肤粗糙度的技术[17]。

过去尝试了各种各样的方法，定量地、非破坏性地测量皮肤的机械性质，如使用抽吸，同轴向伸长，印凹痕，扭转，剪切式震动传播和抛射式测定（ballistometric）技术等等。然而还没有尝试通过使用触觉传感器，来测定皮肤的粗糙度，该方法是通过颤动的手指，先用一指尖轻轻摩擦皮肤表面，使检测表面的改变，接着用手指压住皮肤感知任何一致性的改变。问题是如何定量的记录这种触觉，因为皮肤光滑度和柔软度的触摸检查，总体上依赖主观的感觉。

Sasai 描述了一种新的机器人技术的触觉感受器。传感器装备有在60千赫兹时，引起共鸣震动的指尖传感器。它能清晰地察觉到震荡频率改变时，和位移传感器探测到皮肤受挤压时，固体物质硬度的细微差别。探测器提供了两个参数：一个反映了角质层的表面状态，另一个则反映了深层组织的稳定程度。

水合作用的非破坏性测量：Cardillo等发表的论文提出了一种快速非破坏性评估皮肤水合作用的方法[18]。据说是一种新型、简单和人－机的3C 工具系统；该工具能精确快速测量皮肤的温度，pH，水合作用，透表皮水分丢失（TEWL）和表面皮脂。测定不需要放在空调环境中，因为显示的测量一直能根据他们在22摄氏度，和50%相对湿度的环境条件下自动修正。

触觉的机器人设备：Iida介绍了一种装备有触觉功能的机器人类型测量仪器的开发和应用[19]。

已知的触觉人类传感器评估方法，常常用来评估人类皮肤理化性能。而且该方法是一种专业化技术的物理工具，其标准化是尚未解决的问题。而且其评估结果还很主观，易受实验条件和环境的影响。

基于视频录音带资料演化而来的信息，Iida开发了一种机器人仪器，能检测有弹性应变性物体，例如人类皮肤的柔软度的触觉测量系统。该体系包括多关节型机器人带有一个可以控制和测量压力以及撞击力的手臂。这个仪器运用于人类皮肤动力学性质的测定。从触觉

和机器人仪器之间获得相关性信息。使用这种机器人仪器，能够对人类皮肤的柔软度和弹性，以及面部治疗后这些性质的改变，提供一个较客观的评估。

数字化成像技术的综述：Perednia发表了一篇关于皮肤数字化成像的非常有趣的综述

[20]。主要综述了超声波技术和带有解释产生图像照片技术。

线性皮肤流变仪（LSR）体内法测量仪：Matts等报道了一种新的体内法仪器测量人的角质层机械性质[21]。

这种电动气化仪（GBE）在20年前就已经使用获得角质层的测量，有很高灵敏[22]。一种新型线性皮肤流变仪（LSR）的仪器，用来测定电动气化仪（GBE）的测量原理，但是不包括其元件。一种线性皮肤流变仪（LSR）中力量控制缩影直流伺服系统，传动装置和预调装置重新安置了，电动气化仪（GBE）的磁铁/螺线管布置，消除了对自由摩擦力产生的需求。来自一种机械力的电信号转化的差值，在线性皮肤流变仪（LSR）中得到自动补偿。初始的线性可变微分变压器已经被0.01%灵敏度单位的所替换，而且现在的力大小用50-g 负荷的波长测量。信号发生器，信号调节装置和储藏示波器，也已经被使用者简便地用一小型便携式计算机驱动的软件所代替。这种新的设计较电动气化仪（GBE），能提供更好的内在精确度，而且仅需要最小限度的维修。

线性皮肤流变仪（LSR），已经显示能够提供角化层结构的灵敏测量。它用来测定角质层对两种有别于相关水合作用性能的局部润湿性治疗的机械反应，因为是一种全电阻的测量仪器，两种产品的相关性能用线性皮肤流变仪（LSR）测定时，与相应全电阻数据比较显示了线性皮肤流变仪（LSR）分辨角质层，应答水合作用的增缩变化程度的能力。

表面活性剂的电子自旋共振（ESR）研究：Kawasaki报道了使用电子自旋共振（ESR）技术，研究阴离子表面活性剂对角质层脂质双分子膜的影响[23]。脂质双分子膜上的SLG,5-去氧硬脂酸（5-DSA），与处理和未处理的角质层混合起来，被用来作为自旋标记。

一份1%的SLS 溶液，将使电子自旋共振（ESR）光谱产生的显著变化，这意味着SLS 影响自旋标记物与脂质粘合蛋白的粘合，并引起双分子膜流动性的增加。另一方面，用1%SLG溶液处理的角质层电子自旋共振（ESR）光谱，也有一些细微的变化。脂质双分子膜流动性的增加，说明皮肤屏障功能的削弱。

这项电子自旋共振（ESR）技术，可以提供一种获得阴离子表面活性剂，以及其他应用于皮肤的材料，所引起的亚临床刺激电压的简易方法。

羰基是具有氧化特性破坏力的生物标记物：Thiele 等调查了人类角质层的羰基大分子，作为环境氧化剂暴露的生物标记物[24]。

角质层存在的羰基量，可以充当环境中对皮肤具有氧化破坏性的内在的放射量测定物。为了调查羰基在人类角质层的积累量，皮肤需要被带状剥离。这些带状物进一步用2，4-二硝基苯肼，大鼠抗-DNP、小鼠IgG、碱性磷酸酯酶以及p-硝基苯磷酸酯交联并培养。Thiel等测量了405纳米下的吸收度，并评估了结果中的羰基量。在体外的角质层处于以下的氧化剂：次氯酸（1,10,100mM）；臭氧（0,1,5,10ppm两小时）或者紫外线（280－400nm；0,4,8或者24J/cm2）。

结果显示暴露于氧化剂下的角质层，所含有的羰基量增加。而且，角质层羰基量在晒黑的部位，相对于未晒黑的部位也有所增加，这也说明了体内氧化剂的损伤作用。例如相对晒黑的部位，我们可能提到手背（0.43+0.06nmol/cm2）,其次是四肢（0.32+0.04；n=11,p

(2)皮肤体外筛选试验技术(In Vitro Screening Techniques in Dermatology) 每年，化学和生物技术公司向市场推出新的合成和天然产品。其植物产品（如芥菜，杏仁，椰子油，藏红花，姜黄根，罗勒，生姜和紫檀）[25,26,27],和乳类产品已经在化妆品中应用了好多年，但是我们不能完全了解这些活性成分的生物活性。新的或老的原材料可以引起刺激和过敏反应。因此，在制成终端产品之前，有必要对这些原材料进行筛选。

理论上，试验应该在人体上进行，然而因为新产品有着未知的潜在的副作用，这样的试验经常不可能在人体实现。我们优先选择的是动物试验。按科学的方法，动物皮肤和人类皮肤之间，有显著的生物化学和结构学差别。因此，试验推断的结果可能不太精确。进一步说，有很大的需要来减少和替代动物试验。

考虑到使用试验动物，对产品进行安全性试验所存在的科学和社会问题，体外法技术是必需的。为了化妆品和皮肤病理学产品的开发，使用体外试验筛选一系列的皮肤细胞（纯培养），和活性皮肤等价物的活性成分。这种体外试验被证实有助于安全性和功效评价，并指导正确选用活性成分。

人类细胞系列（例如角化细胞，纤维原细胞，黑素细胞和郎格罕细胞等），和培养的皮肤模型，具有许多优于体内试验的特点。最重要的一个是消除进行动物试验的必需性。一般体外实验廉价、快速并允许同时筛选多个化合物。它也消除了使用体内试验时所包含的变化，例如年龄、体重、暴露阳光强度和药物以及其他环境因素。它更加准确和精确。

以下描述了各种体外模型和化妆品以及制药工业上的试验方法。

模型

细胞培养：一些相对容易定义的细胞群：角化细胞，黑素细胞,郎格罕细胞，纤维原细胞和皮脂细胞，能从人类皮肤中分离出来，并应用于各种活性成分的生物活性试验中。活性皮肤等价物，纯培养更经济和更容易获得。基于形态和功能，每一个细胞系都有各自的特点。

角化细胞，原始的表皮细胞类型，在形状上不规则。它们合成大量的生长因子，蛋白和酶[28]。角化细胞分化并形成一个保护膜：即我们常说的角质层（SC）,用以抵制病原体，防止体液的流失和抗磨损。

黑素细胞是表皮中第二类主要细胞类型。它们是位于皮肤基层的大树枝状细胞。其功能是分泌黑色素，以保护周围细胞免受紫外线辐射的伤害。它们经由树枝状结晶，将黑色素转运至邻近的角化细胞。

郎格罕细胞是表皮中第三类主要的细胞类型。这些细胞在皮肤的免疫系统中，发挥着重要的作用。郎格罕细胞的原始培养，不如角化细胞和黑素细胞稳定，因此在体外模型中也不多见。

纤维细胞是真皮中主要的细胞类型。他们在体外研究的开发，也已经有很长时间，大概是因为与其他细胞系相比，它们在培养中具备的较强活力和生长能力。这类细胞的主要功能，是合成细胞外矩阵蛋白，例如胶原酶，弹性蛋白酶和其他金属蛋白酶[29]。

皮肤有一种分泌油性的腺体，被称为皮脂腺。Karasek等第一次从该腺体中，分离出皮脂细胞[30]。角鲨烯是皮脂细胞中主要的脂类物质。维他命A 酸能抑制皮脂细胞分泌，可以作为抗粉刺活性剂。为了开发防干燥和抗油性皮肤的化妆品和药剂，就必须采用体外法筛选控油成分，来抑制皮脂细胞分泌的角鲨烯和油性产物。

然而，使用纯细胞培养试验终端产品，也有不足和局限性。细胞培养不适合研究细胞与细胞之间的相互作用。为了说明这些难题，研究者已经介绍了培养皮肤的模型。

活体皮肤等价物：培养的皮肤允许局部外用试验材料，当作人体皮肤使用，而且还能细胞之间的交流[31,32]。Mattek Co.推荐一种物质称为Epiderm，它由高度分化的角化细胞组成，在人体表皮发现是处于基部刺状颗粒和角质层。

表皮的标志物，例如角蛋白，丝状包壳和1型谷光转化酶,已经在表皮模型中定位发现。黑素细胞也被Epiderm 融合进入Melanoderm。树枝状的黑素细胞定位在基底层。两个模型（Epiderm表皮和Melanoderm 黑素表皮）都由表皮构成；他们缺少真皮。Bell等研发了一种表皮和真皮都包括在内的完整厚度的模型。一些研究者在实验室使用双分子膜的皮肤等价物，进行体外实验[33,34,35]。

以上所有模型，纯细胞培养和皮肤等价物，都有价值地对原材料和终端产品的生物化学和物理学反应进行试验。然而，为了期望获得一个关于实验材料的生物活性有效结论，我们就必须选择一种合适的体外模型，和一项适当的技术方法来进行特定的试验，如Fig.5-1体外皮肤试验所用模型、标记物及技术。

Fig.5-1

体外皮肤试验所用模型、标记物及技术

试验

透皮吸收（Percutaneous absorption ）：

透皮吸收包括四个主要的环节:

*从应用的基质相，扩散穿过角质层（SC）；

*从角质层（SC）的分隔向增殖表皮扩散；

*穿越表皮和上层真皮的扩散；

*毛细管吸取。

经由皮肤的吸收能在体外通过对皮肤等价物模型，整体应用放射活性的物质进行研究。体外这样的试验，在对活性成分正确选择赋形物时十分有用，因为如果他们渗入角质层（SC）或者表皮的更深层，大部分都会作用的很好。功能化妆品的活性成分渗入的速率和程度依赖于赋形物。

细胞增殖：使用各种技术来测定细胞的增殖。主要的技术是适于活性成分试验的细胞培养。我们在显微镜下数细胞量，可以使用血球计或者测定细胞的DNA。DNA的定量，可通过测定合并的放射活性的胸腺嘧啶核苷酸，或者使用荧光染色那些调节角化细胞，纤维细胞或者黑素细胞的活性成分来实现。

细胞分化：角化细胞和表皮都是研究不同活性成分或者终端产品对分化标志物，例如作为包膜（involucrin）和角蛋白1，10和14合适的试验模型。这些标志物，能通过Western 斑点和放射性免疫测定，酶联免疫吸收检测（ELISA）或者流动细胞仪进行分析。活性成分例如乳蛋白，氨基酸，维生素和一些植物提取物，促进纤维原细胞和角化细胞的生长。测定这些活性成分存在时的细胞生长，以此研究它们各种浓度下的相关活性。

毒性：三维立体的人类表皮和真皮模型，已经显示体外试验模型检测皮肤刺激性，腐蚀性和光毒的生物化学和形态学效应。一种产品或者一个刺激性成分，渗入角质层和表皮，释放前列腺素和细胞激活剂例如细胞白介素。放射性免疫测定或者酶交联的免疫吸收检测（ELISA）等技术，检测前列腺素E2(PGE2)和细胞白介素例如IL-1αorIL-8。这些试验与局部应用原料（例如表面活性剂，AHAs和BHAs，天然提取物，油类，毛发染色剂和护肤或者染料产品）后人体支配的应激性反应相关联。细胞的发育能力常常通过

MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide)化验，测定线粒体酶的活性来表达。

黑素的生成：黑素的生成包括黑色素的合成和转运。黑素细胞自然状态下呈树突状，它们转运的黑色素体，包含通过它们树突传给角化细胞的黑色素。黑素细胞含有高水平的酪氨

酸酶活性，这一特点被认为是此类细胞生物化学上的标志。酪氨酸酶促进酪氨酸羟基化，转变为二羟基苯丙氨酸（DOPA），接下来转变为二羟基苯丙氨酸（DOPA）醌和黑色素。通过用L 型二羟基苯丙氨酸（DOPA）处理黑素细胞，来测定酪氨酸酶的活性。

无论是黑素表皮（一种人体表皮模型），或者黑素细胞的纯细胞培养，都能用来研究黑素的生成，和整体应用化妆品以及药物产品时的光照生物作用。

美白产品的成功开发，取决于使用有效的脱色或者酪氨酸酶抑制性的活性成分。维生素C 磷酸镁（MAP），抗坏血酸维生素C，曲酸，arbutin和氢醌,都用来做黑素细胞试验的材料。这些活性成分的大部分十分不稳定；因此，为了确定临床后续使用的合适赋形剂，试验我们必须首先准备一系列赋形剂的材料，来试验黑素表皮。

伤口的愈合：细胞外矩阵降解酶的削弱，是伤口修复整体过程的一部分。这些酶包含在伤口清理，基底膜分解，临时矩阵翻转和接下来的长期组织改造之中。此外，伤口处一般会开始分裂细胞，周围细胞转移过来填充伤口，来修复受伤组织成为原来结构。

基于伤口愈合过程中的生物学观察，研究者已经开发出，一种借助纤维细胞的细胞转移测定法。单层的纤维细胞能通过用刀片刮除一些细胞致伤。接着细胞将转移到清除致伤的部位。这种方法允许我们对促进转移过程的活性原料，进行生物学测定。

一个完整的皮肤等价物，能用来研究介导伤口愈合的产品功效。在对皮肤等价物，局部应用了这些产品之后，我们能测定伤口愈合的标志物，例如胶原蛋白，纤维蛋白和其他细胞外矩阵蛋白。我们还能测定它们的降解酶，例如矩阵代谢蛋白酶。

抗衰老：慢性老化和光老化都与皱纹，弹性的丧失，自我修复能力的衰弱，以及免疫系统功能的下降相联系。皱纹和弹性的丧失与胶原蛋白的减少，弹性蛋白的减少，以及它们的降解酶减少有关。许多临床和形态学的研究已经显示，一种抗光老化作用的维生素A 酸，伴随新的真皮胶原蛋白沉积，和矩阵降解酶的减少，在临床上对皮肤光损伤，有很大的改进。

使用一种三维立体的双分子膜皮肤模型，我们能筛选出抗老化的活性成分，例如维生素A 及其衍生物，抗坏血酸维生素C 及其衍生物，AHAs 和植物提取物等等。我们在合适的赋形剂中，加入活性成分并应用于活性皮肤模型中。通过测量细胞外矩阵蛋白，我们就能判断出，这些活性成分的相关生物学活性。

另外，研究者已经阐明：由于紫外线照射，污染和体内自由基造成的皮肤老化，通过应用抗氧化剂，例如黄酮类、有机酸类、生物碱类、多糖类、维生素C 和E 能够抗自由基，并对皮肤抗这些损伤提供保护。Asuncion等开发了一种方法，它允许对角质层（SC）直接使用试验功能化妆品或活性物，评估使用表皮或者黑素表皮模型时的抗氧化功效。为了评估植

物提取物中黄酮类、有机酸类、生物碱类、多糖类、维生素E,维生素C 和AHAs 的抗氧化活性，这些研究者测定了前列腺素E2(PGE2)和脂质过氧化氢物，这些是氧化过程中重要的两个标志物。

总之，三维立体的皮肤培养还不完善。它们缺少人类皮肤中的毛囊，脂肪分泌腺，血管，汗液排泄管和感觉神经。然而，在开发化妆品和药物产品的过程中，它们是在人体上试验活性成分和赋形剂之前，十分有用的筛选工具。体外试验结果的准确解释，取决于选择正确的模型和试验方法及其技术，以及标准化或者优化的测试法。最后，为了正确判断功效化妆品的生物活性，选择负面和正面的控制方法，也是十分的重要。

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作者简介：万洁（1978-），女，甘肃人，硕士研究生，电话：[1**********]E-mail ：通讯联系人：刘毅，北京大学医学部教授，电话：（010）82893767

E-mail ：[email protected]

Application of modern science and technology in the

cosmeceuticals

LIU Zheng, LIU Ping, YE Xiao-rong ,LIU Yi

（NatureBio-tech.Institute,Health Science Center,Peking University,100191,China ）

Abstract:Cosmeceuticals belong interdisciplinary. It is thanks to research today's biochemistry, physiology, pharmacology, dermatology, pharmacology, cell biology, chemical engineering, modern analytical instruments and other related disciplines to grow and build itself. This article focuses on the application of modern scientific and technological methods in functional cosmetics research and development.

Key words:Cosmeceuticals; modern scientific and technological methods; application