象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因的克隆及其RNAi效应分析
植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA
41(5):473-481(2011)
象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因的克隆
及其RNAi 效应分析
卓侃
1#,
迟远丽
1,2#,
111*
扈丽丽,罗梅,廖金铃
2
(1华南农业大学资源环境学院植物线虫研究室,广州510642;珠海出入境检验检疫局,珠海519015)
pel-1,摘要:从象耳豆根结线虫中首次克隆了果胶酸裂解酶基因Me-该基因cDNA 的开放阅读框(ORF )长813bp ,编码270个氨基酸,PEL-1与南方根结线虫的果胶酸裂解酶MI-PEL-1和爪具有果胶酸裂解酶第3家族的4个保守域特征。ME-PEL-1相似性最高,PEL-1也与它们最为接近。利用RNAi 技术对哇根结线虫的果胶酸裂解酶MJ-且系统进化树显示ME-pel-1进行沉默,pel-1基因被干扰后,象耳豆根结线虫2龄幼虫的Me-结果发现Me-象耳豆根结线虫2龄幼虫对番茄的侵染pel-1基因在象耳豆根结线虫侵染寄主的过程中发挥重要作用。率显著降低。该结果表明Me-关键词:象耳豆根结线虫;果胶酸裂解酶;克隆;RNA 干扰
Cloning and RNA interference analysis of a pectate lyase gene of Meloidogyne
2#
enterolobii ZHUO Kan 1#,CHI Yuan-li 1,,HU Li-li 1,LUO Mei 1,LIAO Jin-ling 1(1Laboratory of Plant
Nematology ,College of Natural Resource and Environment ,South China Agricultural University ,Guangzhou 510642,China ;
2
Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau ,Zhuhai 519015,China )
Abstract :Cloning and characterization of a cDNA encoding pectate lyase from the root-knot nematode Meloidogyne enterolobii is described firstly.The full length cDNA (Me-pel-1)containing a 813bp open read-ing frame (ORF )that could be translated into a 270amino acids polypeptide.The deduced protein including four conserved regions possesed characteristic of the class Ⅲpectate lyases and showed the highest identity
PEL-1from M.javanica.The phylogenetic tree based on the class with MI-PEL-1from M.incognita and MJ-PEL-1was the most closest to the two proteins mentioned above.Infection Ⅲpectate lyases also indicated ME-tests of tomato with secondary juveniles (J2s )of M.enterolobii incubated in dsRNA against Me-pel-1resulted in lower infection efficiency ,indicating the importance of the gene for plant penetration.Key words :Meloidogyne enterolobii ;pectate lyase ;cloning ;RNAi
中图分类号:S432.45
文献标识码:A
0914(2011)05-0473-09文章编号:0412-
象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii )寄
主范围广,繁殖率高,毒性大,可寄生携带Mi 抗性基因的番茄(Solanum lycopersicum )和辣椒(Capsi-cum frutescens )[1 3]。该线虫最早是在我国海南省儋州市象耳豆(Enterolobium contortisiliquum )树上
发现的一个新种
[1]
。近年来调查表明该线虫在我
国南方地区分布较广,且严重危害多种作物,目前
已在豆科(Fabaceae )、茄科(Solanaceae )、葫芦科(Cucurbitaceae )、竹芋科(Annonaceae )中的20多种经济作物及番石榴(Psidium guajava )、莲雾
09-30;修回日期:2011-06-20收稿日期:2010-045B );国家公益性农基金项目:国家自然科学基金项目(30871628;31071666);国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08009-050-4)业科研专项资助(nyhyzx07-:,,,mail :jlliao@scau.edu.cn 通讯作者廖金铃教授博士生导师主要从事植物线虫学研究;E-mail :zhuokan@scau.edu.cn ;共同第一作者:卓侃(1979-),男,福建福鼎人,助理研究员,博士,主要从事植物线虫学研究;E-mail :cylvzdb@163.com 。迟远丽(1982-),女,山东烟台人,硕士,主要从事植物线虫检疫研究;E-
(Syzygium samarangense )等热带水果上分离到该线虫
[4 7]
。在国外,象耳豆根结线虫也越来越受到
[2]
1
1.1
材料与方法
材料
欧洲首次报道象耳豆根结线虫关注。2008年,。
EPPO 报道中国出口欧洲的玫瑰花上截获到同年,
EPPO 对该线虫进行风险性评估,该线虫,认为对中欧地区作物存在较大威胁在越南首次发现
[8]
[3]
供试象耳豆根结线虫采自广东番禺辣椒上,经
单卵囊纯化后培养于本实验室的番茄上,番茄品种为枝添金六号。1.21.2.1
方法
。2009年,该线虫
[9]
。更令人关注的是,Xu 等在
2004年提出玛雅古根结线虫(M.mayaguensis )和象耳豆根结线虫可能是同种异名。玛雅古根结线
虫是国际上公认的危害最大的根结线虫之一,可寄在美洲、非洲、欧洲等均有分生超过8科的植物,布
[10 12]
象耳豆根结线虫2龄幼虫的收集将接种
象耳豆根结线虫2龄幼虫(J2)35d 的番茄苗根部
。近来,玛雅古根结线虫与象耳豆根结线
[13,14]
冲洗干净,挑取卵囊室温孵化3d 后收集根结线虫
2龄幼虫,M9缓冲液清洗后备用。1.2.2
象耳豆根结线虫RNA 的提取及cDNA 合成采用TRIzol 法提取象耳豆根结线虫2龄幼虫的RNA ,参照Invitrogen 公司的TRIzol Reagent
虫是同种异名已被国际大多数学者承认。可
象耳豆根结线虫已成为全球热带、亚热带地区见,
作物的一个重要病原物。
植物线虫的食道腺分泌蛋白在线虫侵染和寄生寄主植物的过程中起到很重要的作用
[15]
。近年
说明书进行操作。RNA 用DNase I 37ħ 下处理30
min 以去除残余的DNA 。用BD SMART RACE cDNA Amplication Kit 合成第一链cDNA ,按试剂盒说明书进行操作,合成的cDNA 置于-80ħ 待用。1.2.3
象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因Me-pel-1cDNA 全长的扩增根据GenBank 中南方根
来,越来越多的植物线虫食道腺细胞表达基因得到克隆与鉴定,包括果胶酸裂解酶基因在内的一些植物细胞壁降解酶基因是研究热点之一
[16,17]
。果胶
酸裂解酶基因的产物果胶酸裂解酶是许多植物病
病原物在该酶参与下降解植原物的重要致病因子,物细胞壁以便侵入寄主和定殖
[18]
。在植物线虫
中,果胶酸裂解酶基因最早从马铃薯金线虫(Glo-bodera rostochiensis )中分离获得Pel-1[19]。随后,果胶酸裂解酶基因先后在一些重要的植物病原线
虫中报道,包括大豆孢囊线虫(Heterodera gly-cines )的Hg-pel-1
[20]
pel-1结线虫的果胶酸裂解酶基因Mi-(AY515702)和爪哇根结线虫的果胶酸裂解酶基
pel-1(AF455757)及其他同源物种果胶酸裂因Mj-解酶基因的核苷酸序列,设计一对覆盖开放阅读框
(ORF )的简并引物扩增象耳豆根结线虫的果胶酸裂解酶基因cDNA 全长。其中正向引物为PelS :5'-ATGTTKWCAAGCAAAACTAGCTTC-3' ,反向TTARTTCTTTGCGCTCTTTTT-引物为PelA :5'-GCT-3' 。PCR 反应体系(25μL ):cDNA 模板2μL ;10
! PCR Buffer 2.5μL ;dNTP (2.5mmol /L)2μL ;引物PelS (10μmol /L)和PelA (10μmol /L)各1μL ;Ex Taq (5U /μL )0.125μL ;灭菌ddH 2O 16.375
94ħ 变性30s ,μL 。PCR 程序:94ħ 预变性30s ,
57ħ 退火30s ,72ħ 延伸2min ,35个循环;72ħ 延
伸10min 。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 产物切胶回收,18T 载体,连接到pMD-最后转化克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。1.2.4
序列分析通过NCBI 进行同源序列检
索,用DNAStar6.0进行相似性分析,采用
、爪哇根结线虫(M.javanica )、松材线虫(Bursaphelen-[24]
pel-1[21]、的Mj-南方根结线虫(M.incognita )的Mi-pel-1和Mi-pel-2
[22]
chus xylophilus )的Bx-pel-1和Bx-pel-2[23]、甜菜孢囊线虫(H.schachtii )的Hspel1和Hspel2
及马
pel2[25]等。Doyle 等[21]提出如铃薯金线虫的Gr-果能找到线虫果胶酸裂解酶的抑制子并让其在植
物中表达,就可能使植物产生抗性,从而阻止线虫达到防治线虫的目的。象耳豆根结线虫的寄入侵,
生性相关基因尚未见报道。本研究首次克隆了象耳豆根结线虫的果胶酸裂解酶基因,并利用RNAi 技术初步分析了该基因的功能,以期为深入研究象耳豆根结线虫的分子机制及发展新的防治策略提供初步信息。
DNAMAN 进行多序列比对及利用Mega4.0构建
[26]
利用国际系统发育树。参考Nielsen 等的方法,互联网上的ProtParam (http ://www.expasy.org /
tools /)工具对氨基酸序列进行分析。1.2.5
RNAi 试验象耳豆根结线虫果胶酸裂解Pel-1的RNAi 采用dsRNA 浸泡方法。酶基因Me-dsRNA 合成采用体外转录的方法,体外转录的模
Pel-1基因的特异板DNA 用含有T7启动子的Me-引物扩增合成。两对扩增引物分别为MepeLST7:
5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGGCT-TGGAAACGGAAATCAGG-3' 和MepeLA :5'-TT-GCCACAGGAGCGACAGAA-3' ;MepeLS :5'-GCT-TGGAAACGGAAATCAGG-3' 和MepeLAT7:5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGTTGCCA-CAGGAGCGACAGAA-3' 。PCR 反应体系与1.2.3
PCR 程序为:94ħ 预变性2min ;94ħ 变性30相同,s ,58ħ 退火30s ,72ħ 延伸1.5min ,32个循环;72ħ 延伸7min 。以获得的PCR 产物为模板,利用T7转录酶合成单链RNA 后,再经过退火合成dsR-TM NA ,按照T7RiboMAX Express RNAi System 说明书进行操作。dsRNA 用DNase I 37ħ 下处理15min 以去除残余的DNA 。
将收集的象耳豆根结线虫2龄幼虫置DEPC 处理的离心管中,对照组、试验组各收集约20000
M9缓冲液清洗2遍后,条虫,将水吸干,对照组加入45μL M9缓冲液,试验组加入45μL dsRNA (2
25ħ 浸泡4h ,μg /μL ),每隔一段时间轻微摇动离
心管。浸泡结束后用M9缓冲液清洗2次。1.2.6RT-PCR 检测分析分别提取经dsRNA
浸泡和未经dsRNA 浸泡的象耳豆根结线虫2龄幼虫的RNA ,然后反转录成cDNA 并平衡两者cD-NA 的浓度。以平衡后的cDNA 为模板,设计引物
PCR 的扩增象耳豆根结线虫的actin 基因作为RT-GTCATGGTCGG-内参,引物分别为MeactinF1:5'-TATGGGACAGA-3' 和MeactinFR :5'-CTTGCTTG-GAGATCCACATCTGTTGGAAG-3' 。以引物Me-pel-1。PCR 反peLS 和MepeLA 扩增靶标基因Me-应体系与1.2.3相同。PCR 程序为:94ħ 预变性
30s ,94ħ 变性30s ,58ħ 退火30s ,72ħ 延伸1.5min ,28个循环;72ħ 延伸7min 。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测,pel-1的测定两者Me-mRNA 表达量差异。
1.2.7RNAi 后线虫的表型观察及侵染力检测
将经RNA 干扰和未经RNA 干扰的象耳豆根结线
在显虫2龄幼虫用M9缓冲液清洗后置于清水中,
微镜下每隔15min 观察线虫的形态行为变化及判断死活。
挑取经RNA 干扰和未经RNA 干扰的象耳豆
分别接种于生长根结线虫2龄幼虫活虫300条,
25d 的不含Mi 抗性基因及含Mi 抗性基因的番茄
5、15和25d 后取样,每个处理3次重复。苗根部,
将番茄根部用自来水洗净后,采用次氯酸钠-酸性品红染色法
在显微镜下观察线虫的侵染情况,计算侵入番茄根部的虫数,并利用软件DPS7.05,采用Duncan 新复极差法进行差异显著性分析。
[27]
2
2.1
结果
Me-pel-1cDNA 全长的扩增及其预测蛋白的特征分析
以象耳豆根结线虫cDNA 一链为模板,用简
并引物PelS 和PelA 扩增获得一约800bp 的特异条带,经测序实际为813bp 。将该序列用blastp 在GenBank 中进行比较,结果与该序列具有较高相似性的为南方根结线虫和爪哇根结线虫的果胶酸裂解酶基因,表明该序列是所需要的象耳豆根结线虫
pel-1(Gen-命名为Me-的果胶酸裂解酶基因序列,
Bank 登录号:HQ180169)。在NCBI 的ORF finder
Me-pel-1包含一个完整的ORF ,进行ORF 识别,起终止密码子为TAA ,编码270个始密码子为ATG ,
氨基酸。根据signal P 3.0Server 程序推测ME-PEL-1的信号肽最可能的剪切位点位于第22-23个氨基酸之间,该氨基酸的理论分子量大小约为29.9kDa ,理论等电点(PI )是6.30。2.2
基因相似性比对
利用DNAStar 进行序列相似性比对,结果表
PEL-1与南方根结线虫果胶酸裂解酶明ME-MI-PEL-1(GenBank 登录号:AAS88579和
AAQ09004)和爪哇根结线虫果胶酸裂解酶MJ-PEL-1(GenBank 登录号:AAL66022)相似性最高,
83.7%和82.6%,相似性分别为84.1%、而与南方
PEL-2和MI-根结线虫另2个果胶酸裂解酶MI-PEL-3相似性只有20.7%和21.5%。ME-PEL-1
与其他植物线虫的果胶酸裂解酶相似性相对较低,与孢囊属(Heterodera )线虫的果胶酸裂解酶相似性在16.7% 30.6%,与球孢囊属(Globodera )线
虫的果胶酸裂解酶相似性在16.1% 35.9%,与滑刃科线虫的果胶酸裂解酶相似性在30.6% 37.3%。ME-PEL-1与一些微生物,尤其是链霉菌
(Streptomyces )果胶酸裂解酶的相似性高于与一些线虫果胶酸裂解酶的相似性,如与加纳链霉菌(S.ghanaensis )、S.thermocarboxydus 和变铅青链霉菌(S.lividans )的果胶酸裂解酶(GenBank 登录BAH85845、ZP_05527732)相似号:ZP_04689686、
39.0%和38.7%。性分别为41.5%、
ME-PEL-1与其余7个植物线虫、1个细菌及
1个真菌的果胶酸裂解酶的多序列比对结果见图1。从图1可见,ME-PEL-1具有4个保守特征区
14个半胱氨酸残基,域,催化域含有4个带电荷残基
。
Fig.1Multiple sequence alignment of Meloidogyne enterolobii pectate lyase 1(ME-PEL-1,HQ180169)protein sequences with the sequences of pectate lyases from other plant-parasitic nematodes ,a bacterium and a fungi
MI-PEL-1(AAQ09004)and MI-PEL-2(AAQ97032)from M.incognita ;MJ-PEL-1(AAL66022)from M.javanica ;HS-PEL-1(ABN14272)from Heterodera schachtii ;GR-PEL-1(AAF80746)from Globodera rostochiensis ;HG-PEL-1
(AAK08974)from H.glycines ;BX-PEL-1(BAE48371)from Bursaphelenchus xylophilus ;SG-PEL (ZP_04689686)from
Streptomyces ghanaensis ;FO -PEL (AAC 64368)from Fusarium oxysporum .The putative signal sequence of M .enterolobii ME-PEL-1protein is boxed.Black bars (Ⅰ-Ⅳ)indicate the conserved regions characteristic of Class Ⅲpectate lyases.
Identical residues are highlighted in black ,highly conserved are in gray.Very highly conserved charged residues are
indicated by an asterisk (☆),while a triangular symbol (△)indicates conserved cysteine residues.
2.3系统发育分析
从GenBank 中选取来自植物线虫、真菌和细
PEL-1有同源性的第3家族果胶酸裂菌且与ME-解酶基因的氨基酸序列,利用Mega 4.0软件,通过
UPGMA 法计算1000次获得分子进化树(图2)。
该分子进化树表明来自植物线虫的第3家族果胶而是形成了酸裂解酶并没有位于同一个进化分支,
4个进化分支(即图2中的NEM 1、NEM 2、NEM
3
Fig.2Phylogenetic analysis of pectate lyases from nematode ,fungal or bacterial origin using UPGMA methods
NEM1,NEM2,NEM3and NEM4represent nematodes ;BAC1,BAC2and BAC3represent bacteria ;FUN1represent fungi.The numbers in each branch points represent the bootstrap support percentages.
和NEM4)。NEM1包括了3个滑刃科线虫种的果
该分支与一些来自细菌的果胶酸裂解胶酸裂解酶,
酶(BAC1)以96%的置信度聚为一支。NEM2包
含了球孢囊和孢囊线虫的几个果胶酸裂解酶,该分支以83%的置信度和NEM1及BAC1聚为一支。
PEL-1与南方根结线虫的果本研究所获得的ME-PEL-1及爪哇根结线虫的果胶酸胶酸裂解酶MI-PEL-1位于同一分支(NEM3),裂解酶MJ-该分支BAC1、NEM2及真菌的果胶酸裂解酶与NEM1、
(FUN1)聚为一支。NEM4包含了南方根结线虫PEL-2和MI-PEL-3及几的2个果胶酸裂解酶MI-个球孢囊和孢囊线虫的果胶酸裂解酶,该分支则与另一些来自细菌的果胶酸裂解酶(BAC2)更为
接近。2.4
RT-PCR 对Me-pel-1基因的沉默效率检测
2.5Me-pel-1的RNAi 效应分析
象耳豆根结线虫2龄幼虫dsRNA 浸泡4h 后,用M9缓冲液清洗干净,然后浸泡在灭菌双蒸水中,观察其表型变化情况。浸泡结束后象耳豆根
15min 后,结线虫呈现僵直状态,线虫出现抽搐现30min 后全部恢复正常活动。象,
将经dsRNA 浸泡和未经dsRNA 浸泡的2龄幼虫分别接种到生长25d 的不含Mi 抗性基因和含Mi 抗性基因的番茄苗根部。结果显示:5d 后侵入不含Mi 抗性基因番茄苗根部的试验组线虫15d 后减少了数平均比对照组减少了78.3%,
28. 0%,25d 后减少了22.0%(表1)。而5d 后侵入含Mi 抗性基因番茄苗根部的试验组线虫数平15d 后减少了55.0%,均比对照组减少了52.1%,
25d 后减少了41.5%(表2)。
MepeLS /Me-利用引物MepeLST7/MepeLA 、
peLAT7及T7转录酶分别合成正义链和反义链的再经过退火合成342bp 的dsRNA 单链RNA 后,
片段。提取经dsRNA 浸泡及未经浸泡的象耳豆根结线虫2龄幼虫的RNA ,反转录为cDNA ,以平衡
用引物MepeLA 和MepeLS 进后的cDNA 为模板,
pel-1基因的扩增,行Me-获得一约350bp 的产物,
经测序后为342bp ,与目的基因进行比对,相似性为100%;同时用MeactinF1和MeactinFR 进行内
获得一955bp 的actin 基因参基因actin 的扩增,
片段。
RT-PCR 电泳结果显示,在最佳循环数和最佳actin 基因表达量一致,退火温度的相同条件下,而
Me-pel-1基因在对照组中条带清晰、明显,而在试验组中条带亮度明显减弱(图3),说明用dsRNA
Me-pel-1基因的表达量明浸泡象耳豆根结线虫后,显下降,但没有完全抑制。
Table 1Numbers of Meloidogyne enterolobii in root tissue of tomato without Mi after inoculation
with J2s soaked in dsRNA against Me-pel-1and in M9buffer at different times
Day after inoculation /d
51525
Number of treatment
2.8ʃ 0.4a 138.3ʃ 3.1a 216.3ʃ 2.8a
Number of untreatment
12.8ʃ 0.6b 192.0ʃ 1.9b 277.1ʃ 3.0b
Fig.3RT-PCR assay for expression level of Me-pel-1gene in Meloidogyne ente-rolobii after soaking in target dsRNA solution
A :M.enterolobii with non-dsRNA treatment ;B :B.xylo-philus with target dsRNA treatment ;Lane M :DL2000DNA marker ;Lane 1:actin ;Lane 2:Me-pel-1.
Data (mean ʃ Se )are from three experiments.The data in the same row followed by different letters are significantly dif-ferent at 0.05levels.
Table 2Num bers of M eloidogyne enterolobii in root tissue of tom ato w ith
in M9buffer at different tim es
M i after inoculation w ith J2s soaked in dsRNA against M e-pel-1and
Day after inoculation /d
51525
Number of treatment
11.3ʃ 1.8a 22.7ʃ 2.2a 45.7ʃ 4.8a
Number of untreatment
23.7ʃ 1.2b 50.3ʃ 4.9b 78.0ʃ 4.6b
Data (mean ʃ Se )are from three experiments.The data in the same row follow ed by different letters are significantly different at 0.05levels.
3讨论
本研究克隆了象耳豆根结线虫的一个果胶酸
且该基因同样具有信号肽,表明该基因可能近,
PEL-1和MJ-PEL-1具有类似的功能,与MI-在象耳豆根结线虫侵染植物的过程中可能起到降解植物细胞壁果胶基质的作用。本研究同时利用RNAi 技术对象耳豆根结线虫2龄幼虫的Me-pel-1基因进行沉默,pel-1基因被干扰结果发现Me-后,象耳豆根结线虫2龄幼虫对含Mi 抗性基因及不含Mi 抗性基因的番茄的侵染率均显著降pel-1基因在象耳豆根低,该结果进一步表明Me-结线虫侵染植物的过程中发挥重要作用。象耳豆根结线虫可以侵染含Mi 抗性基因的番茄和辣椒
[1 3]
裂解酶基因,这是首次报道象耳豆根结线虫的寄生性相关基因。该基因的氨基酸序列具有4个符合第3家保守特征区域和14个半胱氨酸残基,族果胶酸裂解酶的特征
[19,28]
,PEL-1属因此ME-
PEL-1与来自于第3家族果胶酸裂解酶。将ME-其他物种,包括植物线虫、细菌和真菌的第3家族果胶酸裂解酶进行系统进化树构建,该进化树显示来自植物线虫的果胶酸裂解酶并没有聚成一个进化分支,它们彼此之间被一些细菌和真菌形成了4个独立的进化分的果胶酸裂解酶分开,
支。例如,滑刃科线虫的果胶酸裂解酶与链霉菌等一些细菌的果胶酸裂解酶以很高的置信度聚为一支。一些研究认为植物线虫的果胶酸裂解酶基因可能是通过水平基因转移从细菌或真菌当中获得的证。
在根结线虫中,果胶酸裂解酶基因已经在爪哇根结线虫和南方根结线虫中报道,其中在南方根结线虫中报道了3个果胶酸裂解酶基因,通常认为这些基因的产物果胶酸裂解酶在根结线虫侵染植物的过程中被线虫分泌出来,参与降解植物细胞壁的果胶基质以方便线虫在寄主细胞间的迁移
[21,22]
[24,29]
,Me-pel-1基因是否与象耳豆根结线虫克
服Mi 抗性基因相关或象耳豆根结线虫中是否存在其他的果胶酸裂解酶基因有待进一步的研究。参考文献
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责任编辑:于金枝
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