新基因功能的研究策略_字友梅
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Hajdu M ，SebestyénA ，Barna G．Activity of the notch-signalling pathway in circulating human chronic lymphocytic leukaemia cells
新基因功能的研究策略
字友梅
中图分类号：R 331
1△
（综述），王少元
2※
（审校）
（1．福建医科大学研究生处，福州351000；2．福建医科大学附属协和医院血液科，福州351001）
文献标识码：A
2084（2011）10-1478-04文章编号：1006-
摘要：随着分子生物学的进展，新基因功能的研究手段不断增多。现从生物信息学分析、离体
与在体和基因编码蛋白相互作用方面综述近年来有关新基因功能研究的进展，为基因工程等相关领域的研究提供参考。各种方法都有各自的特点和局限性，研究者可根据不同目的筛选最合适的方法，实现对特定基因功能研究的目的。
关键词：新基因；功能；研究策略Advances in Research Methods for Novel Gene Function ZI You-mei 1，WANG Shao-yuan 2．（1．Fu-Fuzhou 351000，China ；2．Department of Hematology ，Union Hos-jian Medical University Graduate School ，
pital of Fujian Medical University ，Fuzhou 351001，China ）
Abstract ：Along with the development of molecule biology ，the novel gene function research meth-ods have been constantly increasing．This article reviewed recent progress focused on the functional re-search of novel genes ，from the perspectives of bioinformatic analysis ，in vitro /invivo and gene-protein
encoding interactions ，in order to provide references for the genetic engineering and other related research areas．All methods have their own pros and cons ，which requires the researchers to select the most appro-priate method according to different purposes to realize the research on specifc gene functions．
Key words ：Novel genes ；Function ；Research strategies
胞及动物水平进行研究，并通过探讨该基因蛋白与蛋白的相互作用而确定新基因的功能。
1新基因的生物信息学分析生物信息学是内涵非常丰富的学科，其核心是基因组信息学，即以基因组DNA 序列的信息分析作为出发点，分析
寻找或发现新基基因组结构，
因，分析基因调控信息，并以
随着人类基因组计划和越来越多的真核生物基
因组的完成，现代基因研究已经步入了后基因组时代。研究的热点从基因测序转移到基因的功能表达与调控。对于新发现的功能未知的基因，首先要通过生物信息学分析对该基因所编码蛋白质的空间结构及功能进行预测，然后应用分子生物学技术在细
此为基础研究基因的功能，研究基因的产物即蛋白
模拟和预测蛋白质的空间结构，分析蛋白质的性质，
质，其结果将为基于靶分子结构的药物分子设计和蛋白质分子改性设计提供依据。生物信息学的研究目标是揭示“基因组信息结构的复杂性及遗传语言
，它已成为整个生命科学发展的重要组的根本规律”
May．2011，Vol．17，No．10医学综述2011年5月第17卷第10期Medical Recapitulate ，·1479·
成部分。其方法主要是利用多种生物信息学分析
分析基因的表达谱、保守性及其编码蛋白的结软件，
构和定位等特征，根据结构预测其功能。目前，生物
其信息学分析已成为新基因功能研究的重要步骤，
主要优点有方便、快捷、经济等，通过生物信息学分析可以初步预测新基因的功能，进而制订下一步研究方案。
在分子生物学中，一个普遍的规律是序列决定结构，结构决定功能。对于DNA 序列，同源搜索除
还有助于确定编码区域，确有助于确定其功能之外，
定基因。人们希望能够直接从蛋白质序列准确地预测蛋白质的结构和功能：①分析序列是否为全长的cDNA ；②序列相似性分析；③电子基因定位分析；④基因组结构确定；⑤编码蛋白性质功能预测。Oti ［2］
等对疾病的潜在基因进行预测和优先排序，对不同的生物信息学策略进行了总结，并列举了一些有用的网络工具和生物信息学方法，为研究疾病相关
［3］［4］
基因提供了范例。张轶文等和李景岗等于2006
cDNA 末端快速扩增法克年应用抑制消减杂交技术、
隆出了人类家族性急性髄系白血病相关新基因全长
cDNA ，并应用目前比较成熟的生物信息学分析方法对该新基因的功能进行了详细的分析。2离体细胞水平研究基因的功能
2．1基因过表达细胞模型基因过表达细胞模型的构建就是通过载体将目的基因转入某一特定细胞中，使其过表达，观察该细胞生物学行为的变化，从而了解该基因的功能。利用该技术可离体研究目的
RNA 、基因在DNA 、蛋白质水平上的变化以及对细胞
增殖、凋亡的影响。目前常用的方法有化学法、物理法及生物法三种。其中化学法价格便宜，被广泛应用于多种细胞的转染，尤其是贴壁细胞，因其转染率
较少用于悬浮细胞；物理法最常用的技术是电穿低，孔法，转染效率较高，但价格昂贵且技术要求较高、费时；生物法是应用病毒载体进行转基因，这类方法以转移效率高、目的基因可稳定表达等优势被广泛应用，但是病毒载体具有选择复制缺陷，复制产生的病毒蛋白导致机体免疫反应，造成靶细胞损伤，使转基因细胞减少，从而影响目的基因的表达。例如，Zhang 等［5］就是利用慢病毒载体将人类家庭互动的蛋白质1基因导入人乳腺上皮细胞中，从而研究该基因的功能。但因基因的表达受转导效率和是否持续稳定表达两方面因素的影响，故要慎重选择转导
［6］
系统。
2．2基因沉默细胞模型基因沉默的原理主要是采用反义核酸分子抑制、封闭或破坏靶基因组，方法有反义寡核苷酸、核酶及RNA 干扰等。反义RNA 技
［1］
术是利用基因重组技术，构建人工表达载体，使其离
反义RNA 能与靶mRNA 形体或体内表达反义RNA ，
成较稳定的二聚体，从而抑制靶基因的表达。其作
转录及翻译多水平上抑制靶用机制是在DNA 复制、
基因的表达。该技术简单易行，已有数以百计的反义寡核苷酸进行了临床前研究和初步的临床试验，
［7］
对靶基因产物和疾病均显示出良好的活性。与反义核酸类似，核酶能靶向众多分子，已经开展对于癌症、感染性疾病等的治疗研究。因核酶有高效专一
因此催化效率较高，但其催化效率高度依赖于结性，构，限制了其作用的发挥。RNA 干扰同样依赖于RNA 和靶mRNA 的互补结合，从而破坏靶mRNA 。
［8］
大量研究标明，与反义寡核苷酸和核酶技术相比，RNA 干扰具有高度的序列专一性和更高的干扰活力，并且具有投入少、周期短、操作简单等优势，因此
［9］
被广泛应用于基因功能的研究。Wilda 等用RNA
BCR /ABL融合基因的融合处作为靶干扰技术，以M-位点，封闭了具有酪氨酸激酶活性的融合基因M-BCR /ABL的融合只有在BCR /ABL的表达。因为M-白血病细胞中才存在，而正常细胞中没有，并且M-BCR /ABL的剔除能强烈诱导细胞的凋亡，所以间接
起到了选择性杀伤白血病细胞的作用。这些研究表
并用于基因功能的分析。明miRNA 能被成功靶向，
3在体细胞水平研究基因的功能
3．1基因敲入基因敲入（gene knock-in ）是利用基
因同源重组，将外源基因转入细胞与基因组中的同源序列进行同源重组，插入到基因组中，建立携带并能够稳定遗传给子代的转基因动物模型，通过表型分析研究外源基因的功能。目前应用基因敲入技术已经经历了数千种转基因动物，并且还可以通过在携带外源基因的载体上加上组织特异性启动子等手段，从而控制外源基因在特定的时间和特定的组织
［10］
器官表达。利用该技术的优势在于它是一个活体水平上的研究体系，可以从分子到个体水平进行多
［11］
层次、多方位的研究。
3．2基因剔除基因剔除是应用DNA 同源重组原理发展起来的一门技术。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因剔除的理论基础。此技术整合位点确定、精确，转移基因频率较高，既可以用正常基因剔除突变的基因，以进行性状的改良和遗传病的治疗；又可以用突变的基因剔除正常的基因，以研究此基因在发育和调控方面的作用。胚胎干细胞的研究使得基因剔除理论在转基因
［12］
Santos 等［13］利动物中的应用成为可能。Gonzalez-用腺病毒载体合成短发夹RNA ，从而将前体mRNA
处理因子3突变基因剔除，可能成为治疗常染色体
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［21］
蛋白质的正确折叠。针对这些问题，近年来研究者对其也进行了诸多改进。如采用多个报告基因以减少假阳性，同时也尝试建立了一些不依赖于转录
如分离的泛素系统和因子活性的新型双杂交系统，
［22］
淋巴细胞招募系统等。另外，近年来已初步建立了哺乳动物双杂交系统，以更好地模拟细胞内环境，
［23］
探明蛋白质相互作用的机制。5结语
显性遗传视网膜色素变性的有效方法。然而，由于
高缺乏有效的转染方式及使等位基因失活的手段，
特异性的胚胎干细胞同源重组是目前基因功能研究
［14］
所面临的巨大挑战。因此，其他方法，如整合酶（phiC31）整合介导的基因插入［15］和锌指核酸酶技术
［16］
介导的基因编辑，被应用于胚胎干细胞同源重组
锌指核酸酶技术介导的基因编辑的研究。事实上，
已分别在人胚胎干细胞和诱导多功能干细胞中
［17，18］
。完成
4基因编码产物相互作用蛋白的研究
4．1蛋白质芯片蛋白质芯片是指通过微加工和微电子技术对固体载体表面进行处理，使其结合抗
DNA 、酶、受体、单链抗体等成为捕获抗原体或抗原、
DNA 结合蛋白、或抗体、底物配体、多样抗原等特异
生物分子的微阵列。其主要用于蛋白表达谱、蛋白质磷酸化以及检测某一种蛋白与芯片上各种蛋白之间是否存在相互作用。如研究新基因及其编码的蛋白功能时，需要鉴定出该新蛋白与其他已知蛋白之间的相互作用。其优点主要有特异性高、亲和力强，可简化样品的前处理，实用性强；能够快速高通量定量分析大量的蛋白样品；蛋白质芯片的所需试剂和
产品化后价格低廉。样品少，
4．2免疫共沉淀技术免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。该技术常用于融合表达的带有蛋白标签的特异性抗体与目标蛋白质结合，形成免疫复合物沉淀。经过洗脱、收集该免疫复合物，再通过对蛋白标签具有特异吸附作用的亲和色谱柱将蛋白复合物分离纯化出来，最后对该蛋白质进行N 端氨基酸序列分析，推断出相应的核苷酸序列。该方法常用来确定生理条件下目的蛋白在细胞或组织内是否存在与其相互作用的蛋白质，也可以应用于验证
［19］［20］
两个已知相互作用的蛋白质。Walker 等利用免疫共沉淀技术发现死亡蛋白和肿瘤抑制因子p53蛋白形成的复合物存在于白血病细胞的细胞质中，而不存在于正常血细胞中。
4．3酵母双杂交系统酵母双杂交系统是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法。其最大优势在于它可以用已经克隆的基因从特定细胞的表达文库中“钓取”与其编码产物相互作用的蛋白质及相应基因序列。它检测的相互作用在体内发生，无需额外的纯化步骤。但是，酵母双杂交系统也存在不少局限性，如突出的“假阳性”问题以及所分析的蛋白质必须定位于核内才能激活报告基因（不利于核外蛋白间相互作用的研究）等。另外，融合蛋白的构建也很可能会影响到
新基因的研究并没有一个完全固定不变的模
上述内容仅是一些基本策略与方法。在实际工式，作中，研究者需要根据具体的基因及条件制订特定的研究方案。通过广大研究者努力创新、国际间的
将会有更多更广泛合作以及新技术新方法的应用，
好的方法出现，越来越多的新基因、新功能资源将被不断挖掘出来，从而造福于人类。参考文献
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功能失调性子宫出血的相关分子机制的研究进展
孙
中图分类号：R711．5
燕※，袁媛△（综述），蒋晓莉（审校）
2084（2011）10-1481-03文章编号：1006-
（广西医科大学第一附属医院妇产科，南宁530021）
文献标识码：A
长因子家族（vascular
endothelial growth factor
的神经内分泌机制失常所致的子宫内膜微环境异常有关。现对子宫内膜的血管功能、性激素及其受
family ，VEGFs ）、成纤维细胞细胞凋亡及基质金属蛋白酶在DUB 中的研究进展予以综述。体，
生长因子家族、血管生成素关键词：功能失调性子宫出血；血管功能；性激素；细胞凋亡；基质金属蛋白酶
表皮生长因子及肾上Research Advancement in Molecular Mechanisms of Dysfunctional Uterine Bleeding SUN Yan ，家族、
YUAN Yuan ，JIANG Xiao-li．（Department of Obstetrics and Gynecology ，the First Affiliated Hospital of Guan-腺髓质素等。其中最重要的gxi Medical University ，Nanning 530021，China ）
碱性成纤维细胞Abstract ：Dysfunctional uterine bleeding （DUB ）is a gynecological endocrine disease ，which clinically 是VEGF 、
manifests mainly as non-organic abnormal uterine bleeding．DUB compromises women's health and with an
（basic fibroblast annually increasing incidence．The etiology of DUB remains unknown ，possibly associated with the abnormal 生长因子
uterine microenvironment disorders caused by the neuroendocrine malfunction．This article reviews endome-growth factor ，bFGF ）和血管trial vascular function ，sex hormones and receptors ，apoptosis ，and matrix metalloproteinases in the sense of
2，生成素2（angiopoiestin-the pathogenesis of DUB．
Key words ：Dysfunctional uterine bleeding ；Vascular function ；Sex hormones ；Apoptosis ；Matrix met-Ang-2）。
alloproteinases
VEGF 是一组能产生多
功能失调性子宫出血（dysfunctional uterine 种效应而且功能强大的细胞因子，对血管内皮细胞bleeding ，DUB ）是由下丘脑-垂体-卵巢轴功能失调所对子宫内膜血管的发生发展有重具有特异选择性，引起的，而非器质性病变引起的异常子宫出血。按要影响。VEGF 与血管内皮细胞表面特异性受体结发病机制可分无排卵性和排卵性DUB 两大类，前者合，使血管内皮细胞增殖，增强血管通透性及血管扩
［2］
多见于青春期及绝经过渡期妇女，后占70% 80%，张度，诱导血管生成。正是由于VEGF 能为血管多见于育龄妇女。其主要表现为月者占20% 30%，DUB 患者子宫内膜中的内皮的形成提供重要基质，
经周期不规则，常伴出血量多，出血持续时间长。微血管形成减少，可能导致子宫内膜血管结构发育DUB 是妇科常见病，且其症状易反复，严重影响着女不良，引起出血。性的健康和生活质量。现已了解其基本病理生理改bFGF 是成纤维细胞生长因子家族的一员，它通变可能是中枢神经系统下丘脑-垂体-卵巢轴的神经有效促进微血管内皮细过与靶细胞上的受体结合，
内分泌调控异常，或卵巢局部调控机制异常所致，也胞有丝分裂，诱导血管生成。以往关于无排卵性可能是子宫内膜或基层局部的调控功能异常。现就DUB 患者子宫内膜中bFGF 及其受体FGF-R1表达DUB 相关因子的研究进展予以概述。的研究结果显示，无排卵性DUB 患者子宫内膜中1与子宫内膜血管功能有关的因子bFGF 和FGF-R1的表达较正常者明显减少，提示
bFGF 与DUB 的发生有密切联系。范秀华等［3］研究目前DUB 的机制尚不明确，其最终表现为子宫
DUB 与子宫内膜血管功能密内膜异常出血。可见，子宫内膜异常出血者其VEGF 和bFGF 的表达发现，
切相关。均下降，两者协同影响受损子宫内膜血管的再生1．1影响子宫内膜血管形成的因子近来研究表功能。［1］
Ang-2是其家族中在病理条件下促进血管生成参与血管形成的因素较多，主要有血管内皮生明，
摘要：功能失调性子宫出血（DUB ）是妇科内分泌疾病，临床表现为非器质性病变引起的异常子
宫出血，严重危害妇女健康，近年来其发病率有逐年上升的趋势。其发病机制不明，可能与调节生殖
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
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