山羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定
第34卷第5期
doi:10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.015
疾病防控49
山羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定
李文杨，刘远，张晓佩，高承芳，陈鑫珠，董晓宁（福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州350013）
不形成芽孢的革兰氏阳性从福建省不同羊场的山羊颈肩部淋巴结脓肿处分离到5株无荚膜、摘要：
球杆菌，该菌在含血清的琼脂培养基上，可生长成直径1～2mm 、干燥、中央凸起、不透明、边缘不整齐、伴有β溶血环的菌落，而在普通培养基上生长不良，在麦康凯琼脂培养基上不能生长。根据其形态学、培养特性、生化特性及致病性试验和动物回归试验结果，判定所分离的5株菌为山羊伪结核棒状杆菌。
伪结核棒状杆菌；分离；鉴定关键词：山羊；
中图分类号：S858.27
文献标志码：A
）０５－００４９－０３文章编号：２０９５－３８８７（２０１４
化培养管均购自杭州天和微生物试剂有限公司。１．１．４药敏纸片头孢噻肟钠、庆大霉素、环丙沙星、恩洛沙星、青霉素、链霉素、呋喃妥因、硫酸新霉素、氟哌酸、氧氟沙星等药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司。１．１．５试验动物试验用１．５ｋｇ左右家兔和６月龄左右山羊均购自非免疫伪结核棒状杆菌疫苗的健康养殖场。
伪结核棒状杆菌病是由伪结核棒状杆菌引起的人和多种动物共患的一种接触性慢性细菌性传染病。感染羊以局部淋巴结发生脓肿、干酪样坏死以及消瘦为特征。近年来，该病在散养、环境条件差的养羊场发病率呈上升趋势，严重影响了养羊业的经济效益。其临床症状主要是感染羊头颈部或肩前淋巴结和股前淋巴结出现大小不等的脓肿，触之坚硬或有波动感，随着病程延长，脓肿逐渐增大，最后形成如鸡蛋大小的脓疱，切开脓疱，流出乳白色粘性液体甚至干酪样脓汁。病羊常因患处肿胀发痒而在围墙或栏杆上摩擦，而引起脓疱破溃，影响采食和休息，感染严重时表现为咳嗽、食欲下降、体重减轻，脓肿破溃后若波及内脏可引起死亡。伪结核棒状杆菌感染病羊常规外科手术处理易复发，药物治疗效果不显著。为了研究该病，对山羊的典型病例进行了病原菌的分离与鉴定。
1.2实验室检查
１．２．１染色镜检取一定量的脓汁用生理盐水作适当稀释后直接涂片，用革兰氏染色法染色镜检。
１．２．２细菌的分离培养将无菌采集的脓汁分别接种于普通琼脂平板、１０％犊牛血清琼脂平板和麦康凯平板上，置３７℃恒温箱培养，然后挑取单个优势菌落接种于普通肉汤、１０％犊牛血清肉汤及琼脂平板上进行纯培养，并涂片镜检。
１．２．３生化试验取上述纯培养物，按常规方法接种于生化试验培养基中培养２４～４８ｈ后观察结果。
１．２．４药敏试验用常规纸片法对上述分离菌进行药敏试验。
1材料与方法
1.1材料及病料
１．１．１病料采集从福建省福清、仙游、福安、尤溪和建阳等地羊场的山羊耳下、肩前及膝前淋巴结脓肿处，局部剪毛、消毒，然后用灭菌注射器从脓疱中采集脓汁，置于灭菌试管内进行病原菌的分离培养。
１．１．２培养基普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、牛血清马丁肉汤和全血琼脂平板等培养基均由本所实验室配制。１．１．３微量发酵管葡萄糖、阿拉伯糖、山梨酸、棉子糖、鼠李糖、麦芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、枸橼酸盐等微量生
1.3动物试验
１．３．１对兔的致病性试验取血清肉汤４８ｈ纯培养物以腹腔注射２．０ｍＬ接种于３只肉兔，另设３只对照。每日观察肉兔发病情况并记录。
１．３．２动物回归试验取血清肉汤４８ｈ纯培养物以颈部皮下注射２．０ｍＬ接种于２只肉羊，另设２只对照。每日观察肉羊发病情况并记录。
2结果
收稿日期：2014-07-14
作者简介：李文杨（１９７２－），男，副研究员，硕士，主要从事草食动物研究。
2.1染色镜检
经革兰氏染色镜检可见大量棒状或球杆状、菌落为
50中国草食动物科学2014年
不透明、边缘不整齐、淡白色的革兰氏阳性细小颗粒样、
菌，无芽孢、鞭毛及荚膜，散在或呈“Ｖ”字型排列。
平板上生长贫瘠，而在麦康凯平板上未见细菌生长。
普通肉汤和血清肉汤在３７℃培养２４ｈ后可见轻度浑浊，血清肉汤混浊更明显，且有白色菌膜出现。在３７℃培养４８ｈ后血清肉汤上部逐渐变清，管底有颗粒样沉淀生成，菌膜进一步增厚。
2.2细菌的分离培养
血清琼脂平板上经３７℃、１８￣２４ｈ的培养，可见菌落白色，干燥、凸起、半透明，直径１￣２ｍｍ，随培养时间延长菌落变为不透明，呈乳白色。菌落表现松软、易碎、易推动，很难挑起，菌落周围具有狭窄的β溶血环。普通琼脂
表1
2.3生化试验
结果见表１。
5株分离菌株生化试验结果
菌株葡萄糖阿拉伯糖乳糖麦芽糖甘露醇山梨醇棉子糖蔗糖鼠李糖木糖果糖枸橼酸硫化氢柠檬酸盐Ｍ／ＲＶ／Ｐ氧化酶ＦＱ
ＸＹＦＡＹＸＪＹ
＋＋＋＋＋
－－－－－
＋＋－＋＋
＋＋＋＋＋
－－－－－
－－－－－
－－－－－
＋＋＋＋＋
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＋＋＋＋＋
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－－－－－
－－－－－
－－－－－
＋＋＋＋＋
注：①ＦＱ、ＸＹ、ＦＡ、ＹＸ、ＪＹ分别为福州福清、莆田仙游、宁德福安、三明尤溪和南平建阳不同羊场的山羊分离株；②糖发酵试验中，“＋”表示产酸，“－”表示不发酵。其他生化试验中“＋”表示阳性，“－”表示阴性。
2.4药敏试验
５株分离菌药敏试验结果基本一致，各药敏纸片的抑菌圈直径分别为头孢噻肟钠３２ｍｍ、硫酸新霉素３０ｍｍ（高敏），环丙沙星１６ｍｍ、氟苯尼考１５ｍｍ（中度敏感），红霉素５ｍｍ（低敏），而妥布霉素、四环素、氧氟沙星、恩洛沙星、哌拉西林、利高霉素、庆大霉素、利福平、氟哌酸、青霉素Ｇ、链霉素、磺胺类和呋喃妥因均无抑制圈。
酪样淋巴结炎为特征的慢性传染病。美国、澳大利亚及日本等国家或地区均有该病发生。临床上该病发展缓慢，在感染初期不易察觉，容易被人们忽视，但由于伪结核棒状杆菌可产生坏死性、溶血性外毒素，严重影响患病羊的生长发育。因此，早期发现极为重要。李国平在２００４年从上海引进的波尔山羊中首次分离出羊伪结核棒状杆菌，证明该菌在福建省存在，近年来有扩大趋势［3］。
粘膜或３）伪结核棒状杆菌主要通过山羊皮肤创口、注射等途径侵入羊体内，除在感染部位形成局灶性脓肿外，还会顺着淋巴管侵入淋巴结引起淋巴结肿大化脓，若感染部位较深或羊体抵抗力较差时，该菌还会经淋巴和血管侵入体内的淋巴结和内脏，虽然病死率不高，但严重影响患羊的健康。由于伪结核棒状杆菌引起的山羊皮下、淋巴脓肿病病灶在形成过程中，表面会形成一层厚而致密的纤维性肉芽肿性包囊，诸多药物都难以通过这层包囊渗入其内，使药物不能均匀地扩散于整个脓肿腔，给治疗造成一定难度，因此在生产上需要寻求一种快速有效的治疗方法。
４）在养羊生产中，由于绝大多数养羊户仅注重一些危害严重疫病的防治，而忽视诸如伪结核棒杆菌病等危害相对较小疫病的防治。虽然伪结核棒杆菌引起的发病率较高，而致死率较低，常被人们忽视，但它却又是世界公认的难以防治的传染病之一，一旦侵入羊群则很难彻底清除，给养羊业的发展造成较大危害，应引起广大养殖户的高度重视［4］。目前本病还没有供临床使用的疫苗，应搞好环境消毒，以预防为主，防止外伤发生是预防本病的关键。
2.5动物试验
接种血清肉汤纯培养物的肉兔，８０￣１１６ｈ内陆续死亡，剖检后可见肝脏、肺脏及肾脏表面有直径１￣３ｍｍ白色稍凸起的结核样病变，挑破后有脓汁流出；接种部位出现化脓灶，后期切开见有白色牙膏样脓汁。
人工感染山羊在１５ｄ内未见明显临床症状，但其采食明显减少。在第１６￣１８天，接种部位及周边的浅表淋巴结出现脓肿，脓肿表面有厚而致密的炎性纤维素性肉芽肿性包囊，触摸坚硬，随着时间推移肿块变大，与周围组织界限变得分明，大小如核桃或鸡蛋大；在第２３￣２５天时部分脓肿破溃，流出黄白色无臭无味的黏稠液体，似干酪样，并将脓汁取出培养后分离到与原攻击菌相同的细菌［1］。
3小结与讨论
１）根据流行病学调查、临床症状、病理变化以及分离菌形态、培养特性、生化特性、动物试验与《伯杰细菌鉴定手册》描述的伪结核棒状杆菌特征基本一致，可判定从发病羊场不同山羊分离的５菌株均为伪结核棒状杆菌［2］。
２）羊伪结核棒状杆菌主要引起绵羊、山羊发生以干
第34卷第5期
doi:10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.016
疾病防控51
乳头液体保护膜“乳宁散”预防奶牛乳房炎效果评价
侯美如，徐馨，黄健冯万宇，周庆民，（黑龙江省兽医科学研究所，齐齐哈尔161006）
选择隐性乳房炎奶牛60头，随机分为摘要：为观察乳头液体保护膜对奶牛隐性乳房炎的预防效果，
5组，每组12头。试验I 组为对照组；II 组为4%次氯酸钠组；III 组为0.5%洗必泰组；IV 组为1%碘伏组；V 组为奶牛乳头液体保护膜浸组。在0、30、60、90d 采用SCC 法和CMT 法检测牛乳中体细胞数并记录临床型奶牛乳房炎发病数和发病率，同时记录各组奶牛泌乳总量和平均泌乳量。结果表明：同对照组相比，各试验组均能显著降低隐性乳房炎病牛体细胞数，且对奶牛乳脂、乳蛋白、乳糖及乳汁pH 值、比重、日均泌乳量几乎没有影响。用于预防奶牛隐性乳房炎时，试验III 、V 的效果高于试验II 、IV 组，差异显著（P
中图分类号：S823.7
文献标志码：A
（２０１４）０５－００５１－０３文章编号：２０９５－３８８７
同时，由于隐性乳房炎损坏了乳腺成更大的生产损失［2］。
减少了某些乳汁成分的合成，并改变乳区的分泌细胞，
的渗透压，使血液中的某些成分渗透到乳中，从而使牛乳中蛋白质、脂肪、乳糖等营养物质发生一定的变化，降低了牛奶的营养组成。
奶牛乳头药浴是控制奶牛场乳房炎较好的方法［3］，现今规模化奶牛场均已把乳头药浴纳入挤奶操作技术０．５％￣１．０％碘规程，比较常用的有０．３％￣０．５％洗必泰、
伏、４％次氯酸钠及０．２％过氧乙酸等［4］。奶牛乳头液体保护膜是黑龙江省兽医科学研究所研制的预防“乳宁散”奶牛乳房炎的新型乳头药浴消毒剂，主要用于挤奶后奶牛乳房药浴。本试验以泌乳期奶牛为研究对象，进行“乳宁散”预防奶牛乳房炎试验研究，以评价其预防奶牛乳房炎的临床效果。
奶牛乳房炎是由物理、化学或微生物等因素刺激奶牛乳腺引发的一种炎症反应，给奶牛生理及生产造成诸多不利影响，按其严重程度分为隐性乳房炎和临床型乳房炎。隐性乳房炎虽然无明显的临床症状，但对奶牛的危害超过临床型乳房炎。有研究认为，奶牛乳房炎造成的损失约７０％可归于隐性乳房炎引起的产奶量下降，目前全世界约有２．２亿头奶牛，隐性乳房炎在产奶牛中的患病率达５０％，西欧部分经济发达国家奶牛隐性乳房炎的发病率为２５％，全球每年因乳房炎造成的损失高达３５０亿美元以上［1］。我国奶牛乳房炎发病率高于世界平均水平，包括隐性乳房炎在内的发病率平均为７０％。隐性乳房炎的危害不仅体现在经济损失上，由于其具有肉眼难以直接发现的特性，使其在生产上具有隐蔽性，从而在牛体中长期存在并会导致病菌在牛群中传播，进而造
1材料与方法
收稿日期：2014-07-17
作者简介：冯万宇（１９７６－），男，副研究员，硕士。研究方向：临床兽医学。
1.1试验动物及饲养管理
从齐齐哈尔市某规模化泌乳牛群中选择经检测确定
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
参考文献
［１］王志芳，杨增岐，宋志军，等．羊伪结核病病原的分离鉴定［Ｊ］．中国
预防兽医学报，２００４，２６（５）：３６５－３６７．
［２］ＲＥ布坎南．伯杰细菌鉴定手册［Ｍ］．８版．中国科学院微生物研究
所，译．北京：科学出版社，１９８４：８３３－８４４．
［３］李国平，陈家祥，王全溪．波尔山羊伪结核棒状杆菌在我省的首次
分离鉴定［Ｊ］．福建畜牧兽医，２００３，２５（５）：１－２．
［４］王韡，张彦明，邢福珊，等．羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定及ＥＬＩＳＡ
检测方法的建立［Ｊ］．中国兽医学报，２００５，２５（１）：３４－３６．