乳鼠心肌细胞的培养

　　摘要：目的:原代培养乳鼠心肌细胞及进行形态学观察。方法：胰蛋白酶和Ⅱ型胶原分离消化心肌组织，差速贴壁和化学方法纯化心肌细胞。结果：12h心肌细胞基本贴壁，1～3天形成细胞簇，并出现同步搏动。结论：胰蛋白酶和胶原酶混合使用可以分离出数量较多、状态良好的心肌细胞。� 　　关键词：心肌细胞；乳鼠；原代培养� 　　中图分类号：R-332文献标识码：A 　　文章编号：1673-7717(2007)04-0691-02 　　随着分子生物学和细胞生物学的发展，细胞水平的研究日益受到重视。体外培养的心肌细胞可保存其结构及功能上的某些特点，具有自发性搏动，可在不受神经、体液因素的影响下，直接进行心肌细胞的生理、病理、药理、毒理及能量代谢等方面的研究�「1」。以及从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子，心肌细胞培养有着广阔的应用前景。根据Simpon�[2]的方法并稍加改进培养乳鼠心肌细胞叙述如下。� 　　 　　1 实验材料� 　　 　　1.1动物1～3天的Wistar乳鼠，由甘肃中医学院SPF级实验动物中心提供。� 　　1.2实验试剂及设备DF培养液：将DMEM培养基与HamF12培养基按1∶1比例混合，5-溴脱氧尿嘧啶：均为美国Sigma公司产品；新生牛血清(NBCS)：杭州四季青生物材料工程研究所；胰蛋白酶和II型胶原酶(上海生物公程有限公司)；α-横纹肌肌动蛋白单克隆抗体(α-sarcomericactin,α-SA)，链霉素亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（strept avidin biotin peroxydase complex, SABC）免疫组化试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司。二氧化碳培养箱(德国Heraeus公司)；超净工作台(苏净集团)；倒置相差光学显微镜(日本Olympus公司)。� 　　 　　2方法� 　　 　　2.1乳鼠心肌细胞的原代培养及纯化根据Simpon�[2]的方法。取1~3天龄Wistar大鼠乙醚麻醉，75%酒精消毒。开胸取出心脏，取心尖部组织剪为1~3mm�3碎块，加入0.08%胰蛋白酶溶液消化10min,待自然沉淀后弃上清。剩余组织块中加入混合消化酶（0.08 %胰蛋白酶+0.04%胶原酶等量加入的混合液）置37℃水浴消化10min，静置后将上清液移入盛有15%新生牛血清的DF培养液的离心管中终止消化，并以1000r/min离心10min，弃上清液，用DF培养液充分吹打成单细胞悬液。剩余沉淀用同样条件及方法反复消化，直至将组织基本完全消化为止。收集各次消化所得细胞悬液接种于100mL培养瓶中。� 　　采取差速贴法壁和化学方法分离纯化心肌细胞。37℃、5%CO�2培养箱中孵育1.5～2h，分离纯化心肌细胞。非心肌细胞贴壁速度较快，首先附在瓶底，心肌细胞仍处于悬浮状态。吸出细胞悬液离心，将沉淀混悬按0．8×10 个／m2 的密度接种于50 mL培养瓶，其中置一0．5 cm×1 cm的盖玻片(预先用鼠尾胶原处理)，以便作免疫组化进行纯度鉴定。用0.1mmol／L 5-Brdu的培养基培养3天，以抑制非心肌细胞增殖，然后换为常规培养基培养，每2～3天换液1次。� 　　2.2心肌细胞的形态学观察及鉴定①光镜观察：用倒置相差显微镜观察细胞。并照像，见图1。②心肌细胞纯度的鉴定：肌细胞纯度的鉴定分别在培养的第1、2、4、8天取出盖玻片。PBS清洗2次，丙酮固定后，用a―SA作免疫组化进行纯度鉴定。� 　　 　　3结果� 　　 　　3.1倒置相差显微镜进行细胞形态学观察刚分离的心肌细胞呈球形，培养4h细胞开始贴壁生长，呈圆形，后变为梭形，细胞贴壁生长并伸出伪足，变为三角形、多边形等。12 h细胞基本贴壁，少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动。第48h细胞伸出伪足相互交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，呈放射状排列的同心圆状，搏动呈同步性。培养的心肌细胞在3～18天无论细胞形态还是细胞括力都良好，在此期间可加各种处理因素进行实验研究。第19天心肌胞活力开始下降，搏动次数减少。第21天时部分细胞停止搏动,细胞皱缩、脱落。� 　　3.2细胞的纯度鉴定在培养的心肌细胞中α-SA抗原表达呈阳性，棕黄色位于胞浆，非心肌细胞中呈阴性。因此α-SA的阳性率可做为心肌细胞纯度鉴定的指标。镜下选10个视野，每个视野200个细胞。计算阳性细胞的比率见表1。� 　　表1培养心肌细胞的纯度(α-SA阳性率) 　　培养天数(天)阳性细胞数(个)细胞总数(个)阳性率(％) 　　 　　4讨论� 　　 　　过去在乳鼠心肌细胞原代培养时，曾采用不同浓度胰蛋白酶消化法，用单一酶消化心肌组织，对细胞膜、细胞内微丝及微管损伤较大，获得的心肌细胞数量少而且活力差。本文采用胰蛋白酶加Ⅱ胶原酶的方法可分离出数量多纯度较高的心肌细胞，提高心肌细胞的存活率，因此消化过程和浓度的把握是原代培养的重要环节。� 　　心脏是由心肌细胞和非心肌细胞组成。其中心肌细胞约占心脏组织的25%，近75%的细胞是非心肌细胞(如成纤维细胞和血红细胞)，其较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，很容易生长成优势细胞。体外培养时非心肌细胞的快速生长与体内的情况完全不同，可能使心肌细胞生长会出现密度抑制的现象�「3」；所以获得纯度高的心肌细胞培养模型对研究方法的科学性及结果的可靠性具有重要意义。� 　　Simpos法�[2]是乳鼠心肌细胞培养的经典方法，但研究发现用此法培养时心肌细胞的收获率和搏动率均较低，故而对其进行了适当的改良。主要有以下几点：①胰酶和Ⅱ型胶原酶合用；②每次消化时间不应过长，多次重复及时终止消化；③消化期间缓慢恒温振荡；④延长差速贴壁时间1.5～2h；⑤延长5-溴脱氧尿苷作用的时间。 　　用改良法培养乳鼠心肌细胞，单细胞收获率高、细胞存活率高、心肌细胞和非心肌细胞分离较彻底、心肌细胞纯度高。用此法制作的心肌细胞培养模型可以满足各种生理及药理实验的要求。 　　本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。