犬科_猫科动物细小病毒血清抗体调查_靳小霞
兽类学报，2012，32（1）：78－82ActaTheriologicaSinica
犬科、猫科动物细小病毒血清抗体调查
靳小霞
1
王化磊
1
王珊
2
梁萌
2
周明
3
王玮
3
刘丹
3
杨松涛
1*
夏咸柱
1*
（1军事医学科学院军事兽医研究所，长春130122）
（2吉林大学畜牧兽医学院，长春130062）（3黑龙江东北虎林园，哈尔滨150028）
关键词：抗体调查；HI；SN；细小病毒；犬科动物；猫科动物中图分类号：S855.3
文献标识码：A
文章编号：1000－1050（2012）01－0078－05
Serologicsurveyforantibodiestoparvovirusincaninesandfelines
JINXiaoxia1，WANGHualei1，WANGShan2，LIANGMeng2，ZHOUMing3，WANGWei3，LIUDan3，YANGSongtao1*，XIAXianzhu1*
（1InstituteofMilitaryVeterinary，AcademyofMilitaryMedicalSciences，Changchun130122，China）（2JilinAgriculturalScienceandTechnologyCollege，Changchun130062，China）（3HeilongjiangSiberiaTigerPark，Harbin150028，China）
Abstract：Ansurveyofantibodiestoparvoviruswascarriedoutincaninesandfelines．Threehundredandninetysixser-umsampleswerecollectedfromseveraldomesticorwildcaninesandfelinesindifferentregionsofChinaduring2009to2011．Serafrom203caninessamplesandfrom193felinesamplesweretestedforantibodiestocanineparvovirusvirus（CPV）andfelineparvovirusvirus（FPV）respectivelyusingmicro-hemagglutinationinhibition（HI）andmicro-serumneutralizationassays（SN）．Theresultsofthetwomethodsarehighlyparallelandconsistent．TheantibodypositiveratetoCPVis28.6%incaninesand42.5%toFPVinfelines．Weproposethatthecaninesandfelineshadbeeninfectedbypar-vovirusindifferentregionsofChina．
Keywords：Antibodysurvey；Canines；felines；HI；Parvovirus；SN
肉食兽细小病毒属于细小病毒科、细小病毒属中的一类病毒，能够感染多种动物，导致犬的出血性肠炎、幼龄犬的心肌炎、猫的白细胞减少、出血性肠炎、幼龄猫的共济失调症以及水貂的肠炎等多种疾病。血清学调查发现，由肉食兽细小病毒引起的疾病存在于世界各地。在我国，无论是家养还是野生动物均有细小病毒相关疫病的流行，对我国犬科和猫科动物的生存和健康构成巨大威胁（许树林等，1996；宋桂强等，2007）。其中猫泛白细胞减少症病毒（Felineparvovirusvirus，FPV）是目前细小病毒属中感染范围最广、致病性最强的一种病毒。FPV是猫的主要传染病之一，同时还能侵袭虎、豹、狮等多种大型猫科动物和浣熊科、鼬科动物（Studdertetal.，1973；Roelkeetal.，1993；邱薇等，2000a；Cameroetal.，2004）。犬细小病毒（Caninesparvovirusvirus，CPV）除能感染犬
基金项目：国家林业局“野生动植物保护司资助项目”（20051201）
外，还能感染狐狸、狼等犬科动物。另外，新亚型CPV－2a、CPV－2b、CPV－2c还能够感染猫、豹、熊、虎等动物（Mochizukietal.，1996；Mar-tinelloetal.，1997；Decaroetal.，2007）。CPV和FPV感染动物之多，致病性之强，致死率之高，对我国经济动物养殖和野生动物保护造成了巨大的威胁。
但到目前为止，国内尚未见到对犬、狐狸、猫、虎和狮等犬科和猫科动物进行比较全面的细小病毒血清学调查的报道。为了解肉食兽细小病毒在中国犬科和猫科动物中的感染流行情况，有效遏制该病的发生，本实验室对2009～2011年间收集的来自我国不同地区家养和野生动物园的155只犬和48只狐狸，总计203只犬科动物的血清进行了CPV的HI抗体和SN抗体调查；36只猫、151只虎及6只狮总计193只猫科动物的血清进行了FPV
作者简介：靳小霞（1986－），女，硕士研究生，主要从事动物病毒学研究．收稿日期：2011－05－16；
修回日期：2011－12－28
*通讯作者，Correspondingauthor，E-mail：[email protected]
1期靳小霞等：犬科、猫科动物细小病毒血清抗体调查79
的HI抗体和SN抗体调查，以期从抗体水平了解肉食兽细小病毒在我国不同地区野生动物中的流行情况，为进一步开展肉食兽细小病毒的流行病学调查及CPV和FPV的免疫预防奠定基础。
入10%双抗过夜，3000r/min离心15min，取上清待检。采用固定病毒－稀释血清法（β法），病毒用量100TCID50，操作流程参见文献（Scottetal.，1970；邱薇等，2000；杨松涛等，2008），以观察细胞病变和测定各孔的血凝效价两种方法判定结
Muench法计算，以能够保护50%细果，按Reed-胞不发生病变（血凝效价小于2倍）的血清最高
稀释倍数作为该血清的50%效价（PD50），中和抗体效价≥1∶30判为抗体阳性（姜平，2001）。
1材料和方法
1.1
血清样品
非CPV和FPV免疫虎、狐狸、狮血清获自中国不同地区野生动物园；犬、猫血清采自东北地区
散养家猫和家犬。收集于2009～2011年，共396份，－70℃保存。犬抗CPV阳性和猫抗FPV阳性血清由本室制备；健康兔血清由本室制备。1.2病毒和细胞
CPV和FPV病毒由本室分离保存，CPV和FPV抗原为CPV/FPV猫肾细胞培养物，由本室制备；F81猫肾细胞引自中国兽药监察所，按常规传代培养。1.3
1%猪红细胞悬液的制备
从健康猪耳静脉或颈静脉采血10～20mL，立即注入1～3倍量的阿氏液瓶中，混匀，4℃可存放5～7d。使用时，先用PBS将保存的猪红细胞以3000r/min离心2min，洗涤沉淀2次，最后以2000r/min离心10min，弃上清及上层白细胞，取此红细胞泥1mL，加稀释液，再加入经56℃灭活30min的健康兔血清0.5mL或牛血清白蛋白0.1g，即为1%猪红细胞悬液，4℃备用。
1.48单位HA抗原的配制及血清样品HI抗体效价的测定
血清的处理：血清样品于56℃灭活30min，加入10%新洗的猪红细胞泥，混匀于37℃吸附1h或4℃吸附过夜，然后3000r/min离心5min后取上清待检。按常规方法测定抗原的HA效价，配制8单位抗原。HI操作流程和结果判定参见文献（杨松涛等，2008；邱薇等，2000b），HI抗体效价≥1∶8判为抗体阳性（姜平，2001）。
1.5CPV/FPV的半数细胞感染量（TCID50）的测定
操作流程参见文献（邱薇等，2000；杨松涛等，2008），以观察细胞病变和测定各孔的血凝效价（以血凝效价大于2倍为阳性指标）两种方法
Muench法计算TCID50。判定结果，按Reed-1.6
血清样品SN抗体效价的测定
血清的处理：血清样品于56℃灭活30min，加
2
2.1
结果
CPV/FPV的半数细胞感染量（TCID50）
按测定值计算，该CPV和FPV毒株的毒力分5.54.43
TCID50/mL。观察细别为10TCID50/mL和10
胞病变和测定各孔的血凝效价两种方法判定的结果
一致。2.2
CPV/FPV的HI和SN抗体效价测定
结果见表1、表2、图1。在中和试验中观察细胞病变和测定各孔的血凝效价两种方法判定的结果基本相同。用HI和SN试验对396份血清样本进行的检测结果表明：155份家犬血清中31份SN抗体效价在1∶30～1∶1000之间、HI抗体效价在1∶8～1∶128之间，占总数的20.0%；16份SN抗体效价＞1∶1000、HI抗体效价＞1∶128，占10.3%；CPV抗体阴性率为69.7%。48份狐狸血清中6份SN抗体效价在1∶30～1∶1000之间、HI抗体效价在1∶8～1∶128之间，占16.2%；5份SN抗体效价＞1∶1000、HI抗体效价＞1∶128，占13.5%；CPV抗体阴性率为77.1%。36份家猫血清中5份SN抗体效价在1∶30～1∶1000之间、HI抗体效价在1∶8～1∶128之间，占13.9%；4份SN抗体效价＞1∶1000、HI抗体效价＞1∶128，占11.1%；FPV抗体阴性率为75.0%。151份虎血清中53份SN抗体效价在1∶30～1∶1000之间、HI抗体效价在1∶8～1∶128之间，占35.1%；19份SN抗体效价＞1∶1000、HI抗体效价＞1∶128，占12.6%；FPV抗体阴性率为52.3%。6份狮血清中1份SN抗体效价在1∶30～1∶400之间、HI抗体效价在1∶8～1∶67，占16.7%；FPV抗体阴性率为83.3%。犬科动物血清CPV抗体阳性率为28.6%，猫科动物血清FPV抗体阳性率为42.5%（表1、2）。从表1和图1结果可以看出，细小病毒的HI抗体效价和SN抗体效价呈高度的平行关系和一致性。
80
表1
Table1
种类Species犬Dogs狐狸Foxes猫Cats虎Tigers狮Lions
HI＜1∶[1**********]
SN＜1∶[1**********]5
兽类学报32卷
血清样品细小病毒抗体滴度分布
Distributionofantibodytiterstoparvovirusinserumsamples不同抗体滴度的血清样本数（份）
Numberofserumsampleswithdifferentwithantibodytiters
SN
≥1∶30；＜1∶1000
3165531
HI
≥1∶8；＜1∶128
3165531
SN≥1∶[1**********]
HI≥1∶1281654190
表2Table2
种类Species
犬科Canines
犬Dogs狐狸Foxes猫Cats
猫科Felines
虎Tigers狮Lions
样品（份）Samples
[1**********]
血清样品细小病毒抗体检测结果
Antibodytiterstoparvovirusofserumsamples
最高抗体滴度HighestantibodytitersHISNHISNHISNHISNHISN
1∶40961∶204801∶5121∶20481∶20481∶81921∶10241∶51201∶641∶384
阳性样品（份）Positivesamples
47119721
阳性率Positiverates30.3%
28.6%
22.9%25.0%47.7%16.7%
42.
5%
HI试验影响因素较多，存在非特可重复性强。HA-异性，但操作简单、快速、方便，可在3～4h内HI试验和SN试验是肉食兽获得结果。因此，HA-细小病毒鉴定和血清学分析的常用手段。为了更客观地反应动物体细小病毒抗体水平，本实验对396份血清同时采用HI试验和SN试验两种方法进行
图1
Fig.1
细小病毒HI和SN效价的关系
了CPV抗体检测，以SN抗体效价≥1∶30、HI抗体效价≥1∶8作为阳性判定标准（Gotoetal.，1981；姜平，2001），结果表明两种方法具有高度的平行关系和一致性。
FPV对猪红细胞在pH值6.5～6.8时具最佳血凝活性，CPV在pH值大于6.8时具最佳血凝活性，且CPV的血凝适宜pH和温度范围较宽，pH值在5.8～7.4，4℃、室温和37℃都有较好的血凝活性（殷震和刘景华，1997）。血清样本中的非特异性抑制物对HI效价的准确性会构成干扰，往往造成检测结果的假阴性或假阳性。本研究采用血清样品检测前加10%猪红血球混匀于37℃吸附1h或4℃过夜，且1%猪红细胞悬液配制时加入0.5%健康灭活兔血清的方法，实验证实此方法可有效地排除非特异性物质的干扰，提高检测的准确性。
国内外的一些研究表明，由肉食兽细小病毒引
TherelationshipbetweenHIandSNtoparvovirus
3讨论
目前，用于肉食兽细小病毒抗体检测的方法很
多，如血凝抑制试验（HI）、琼脂扩散试验、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验、细胞中和试验（SN）等（Scottetal.，1970；殷震和刘景华，1997；邱薇等，2000b；姜平，2001）。SN抗体是机体中和病毒能力的直接反映；肉食兽细小病毒表面含有血凝素，在4℃下可凝集恒河猴和猪红细胞，并且这种血凝特性可被特异性抗体所抑制，其HI抗体的高低也反映了动物机体对细小病毒的免疫水平。中和抗体的检测要在培养的细胞上进行，需1～2周的时间，费时费力但结果相对更稳定，
1期靳小霞等：犬科、猫科动物细小病毒血清抗体调查
Microbiol，27（1）：79－82．
81
起的疾病在世界各地均有流行（Steineletal.，1998；Sagazioetal.，1998；Cameroetal.，2004）。国外的一些研究结果也显示出日本、美国、加拿大等国家肉食动物细小病毒抗体有较高的阳性率（Gotoetal.，1981；Roelkeetal.，1993；Paul-Murphyetal.，1994）。本研究对396份未经细小病毒疫苗免疫的犬、猫、虎、狐狸和狮血清进行细小病毒血清抗体调查，结果显示犬科动物血清CPV抗体阳性率为28.6%，猫科动物血清FPV抗体阳性率为42.5%，说明CPV和FPV在我国东北地区犬科和猫科动物群中感染比较普遍。在151份虎血清中，SN抗体效价≥1∶30、HI抗体效价≥1∶8有72份，阳性率为47.7%。由于其血清样品中来自东北地区送检的东北虎群血清居多，推测该地区的东北虎群中曾发生过FPV的感染或与其它病原混合感染，诱导感染虎产生了较强的抗FPV体液免疫应答，耐过的虎还可能隐性带毒，虎群可能通过与之高度接触而产生FPV抗体，这与之前的报道一致（邱薇等，2000b；杨松涛等，2008；高玉伟等，2010），或者东北虎生活区域早期曾有过猫泛白细胞减少症的严重流行。48份狐狸血清、6份狮血清的抗体阳性率分别为22.9%和16.7%，进一步说明细小病毒严重威胁着我国圈养野生动物的健康，由于虎、狐狸、狮等野生动物在血清样品收集上存在一定困难，所以本次调查还不能全面反映细小病毒在全国范围内的流行情况，有必要进一步调查研究，查明其流行情况并研究相应的防治措施。东北虎是珍贵的濒危动物，更应加强免疫预防，有效遏制该病的发生。在155份犬血清、36份猫血清中，SN抗体效价≥1∶30、HI抗体效价≥1∶8有47份和9份，阳性率分别为30.3%和25.0%，推测CPV和FPV在东北地区散养家犬、家猫中存在隐性感染的情况，可能东北地区早期曾有过细小病毒的严重流行，另外由于现用的细小病毒疫苗大多为灭活苗和弱毒苗，存在灭活不完全和毒力返强的情况，易造成病原体的传播扩散，这与本属病毒多数呈长期潜伏感染状态，不表现出可见的临床症状，常常引起持续感染的特征相符（McVicarandMcEvoy，1985；殷震和刘景华，1997）。参考文献：
CameroM，CavalliA，BozzoG，DecaroN，AlibertiA，MartellaV，
PratelliA，BuonavogliaC．2004．Aseveredualinfectionbyfe-linepanleukopeniavirusandfelinecalicivirusinanadultcat．New
DecaroN，DesarioC，AddieDD，MartellaV，VieiraMJ，EliaG，
ZicolaA，DavisC，ThompsonG，ThiryE，TruyenU，BuonavogliaC．2007．Thestudymolecularepidemiologyofcanineparvovirus，Europe．EmergInfectDis，13（8）：1222－1224．GaoYW，ZhouM，LiuD，WangW，WangLG，YangST，ZhuX
W，HuangG，WangTC，XiaXZ．2010．SerologicsurveyforantibodiestoH5subtypeinfluenzaAvirusintigers．ActaTherio-logicaSinica，30（4）：444－448．（inChinese）
GotoH，HorimotoM，ShimizuK，HiragaT，MatsuokaT，NakanoT．
1981．Prevalenceoffelineviralantibodiesinrandom-sourcelabora-torycats．JikkenDobutsu，30（3）：283－290．
JiangP．2001．VeterinaryBiologicals；Beijing：ChineseAgricultural
PublishingHouse．（inChinese）
MartinelloF，GaluppoF，OstanelloF，GubertiV，ProsperiS．1997．
DetectionofcanineparvovirusinwolvesfromItaly．JWildlDis，33（3）：628－631．
McVicarID，McEvoyF．1985．Canineparvovirusvaccineation．Vet
Rec，20（3）：71．
MochizukiM，HoriuchiM，HiragiH，SanGabrielMC，YasudaN，
UnoT．1996．Isolationofcanineparvovirusfromacatmanifestingclinicalsignsoffelinepanleukopenia．JClinMicrobiol，34（9）：2101－2105．
Paul-MurphyJ，WorkT，HunterD，McFieE，FjellineD．1994．Se-rologicsurveyandserumbiochemicalreferencerangesofthefree-rangingmountainlion（Felisconcolor）inCalifornia．JWildlDis，30（2）：205－215．
QiuW，XiaXZ，FanQS，HeHB，HuangG，YuC，QiaoJ，Wu
YL，FanXJ，WangCH．2000．Relationshipbetweenserumneutralizationantibodyandhemagglutinationinhinitionantibodya-gainstCanineParvovirus．ChineseJournalofVeterinaryScienceandTechnologyinChina，30（10）：3－5．（inChinese）
QiuW，XiaXZ，FanQS，HeHB，HuangG，YuC，QiaoJ，Wu
YL，FanXJ，WangCH．2000．Isolationandidentificationoftiger’sfelinepanleukopeniavirus．ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicine，22（4）：249－251．（inChinese）
RoelkeME，ForresterDJ，JacobsonER，KolliasGV，ScottFW，
BarrMC．1993．Seroprevalenceofinfectiousdiseaseagentsinfree-rangingFloridapanthers（Felisconcolorcoryi）．JWildlDis，29（1）：36－49．
SagazioP，TempestaM，BuonavogliaD，CironeF，BuonavogliaC．
1998．Antigeniccharacterizationofcanineparvovirusstrainsisola-tedinItaly．JVirolMethods，73（2）：197－200．
ScottFW，CsizaCK，GillespieJH．Felineviruses．V．1970．Ser-um-neutralizationtestforfelinepanleukopenia．CornellVet，60（2）：183－191．
SongGQ，LongGW，LiaoJ，NieFP，YuFX，QiuW，LiZS，
FanQS．2007．AdvanceintheresearchofCanineParvovirus．ChinaAnimalHusbandry＆VeterinaryMedicine，34（3）：98－100．（inChinese）
SteinelA，VenterEH，VanVuurenM，ParrishCR，TruyenU．
1998．Antigenicandgeneticanalysisofcanineparvovirusesin
82
兽
southernAfrica．OnderstepoortJVetRes，65（4）：239－242．
类学报
（3）：98－100．
32卷
StuddertMJ，KellyCM，HarriganKE．1973．Isolationofpanleuco-paeniavirusfromlions．VetRec，93（6）：156－158．
XuSL，ShenXL，LiuDX．1996．FelinePanleukopeniaVirusepi-demicandinfectionincarnivore．Heilung-kiangAnimalandVeteri-narySciences，10：40－43．（inChinese）
YangST，ZhouM，WangTC，QiaoJ，WangLG，WangSJ，Liu
D，HuangG，WangW，XiaXZ．2008．SeraantibodiessurveyofFelinePanleukopeniainfelines．ActaTheriologicaSinica，28（1）：101－104．（inChinese）
YinZ，LiuJH．1997．AnimalsVirology．Beijing：SciencePublishing
House．（inChinese）
许树林，沈秀丽，刘鼎新．1996．细小病毒在肉食动物中的感染流
行．黑龙江畜牧兽医，10：40－43．
宋桂强，龙贵伟，廖金，聂福平，于福先，邱薇，李作生，范泉
水．2007．犬细小病毒病的研究进展．中国畜牧兽医，34
邱薇，夏咸柱，范泉水，何洪彬，黄耕，余春，乔军，武银莲，范
秀军，王春华．2000a．桂林老虎猫瘟热病毒的分离鉴定．中国预防兽医学报，22（4）：249－251．
邱薇，夏咸柱，范泉水，何洪彬，黄耕，余春，乔军，武银莲，范
秀军，王春华．2000b．犬细小病毒血凝抑制抗体和中和抗体的关系．中国兽医科技，30（10）：3－5．
杨松涛，周明，王铁成，乔军，王立刚，王淑君，刘丹，黄耕，王
玮，夏咸柱．2008．猫科动物猫泛白细胞减少症血清抗体调查．兽类学报，28（1）：101－104．
姜平．2001．兽医生物制品学．北京：中国农业出版社．
高玉伟，周明，刘丹，王伟，王立刚，杨松涛，朱晓文，黄耕，王
铁成，夏咸柱．2010．虎血清H5亚型流感病毒抗体调查．兽类学报，30（4）：444－448．
殷震，刘景华．1997．动物病毒学．第2版．北京：科学出版社．