紫外线对植物细胞的影响
紫外线对植物细胞的影响
2009300087 刘舒莹 生物技术
【摘要】台盼蓝（C34H24N6O14S4Na4）是一种细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性或检测细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。其作用机理是：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡，这与中性红作用相反。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。台盼蓝染色后，通过显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。
【关键词】台盼蓝 烟草细胞 MS培养基 紫外线
【前言】细胞培养技术也叫细胞克隆技术，一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞。在理论知识的基础上，我们对细胞培养有了一定的了解，并且在平时实验中也积累了一定的经验。为进一步提升动手能力和独立实验的能力，我们对烟草细胞进行悬浮培养后进行紫外线照射，研究紫外线对细胞膜通透性的影响，以期提高自己综合能力的同时能对悬浮培养的细胞有进一步的了解。
1. 实验器料和试剂
1.1实验器材：
吸管 三角瓶 标签纸 烧杯 天平 玻璃棒 移液器 培养皿 冰箱 恒温摇床 高压灭菌桶 超净工作台 酒精灯 载玻片 光学显微镜 枪头 棉线 封口膜
1.2实验试剂：
NH4NO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4·7H2O CaCl2·2H2O MnSO4·4H2O ZnSO4·7 H2O KI H3BO3 Na2MoO4·2 H2O CoCl2·6H2O CuSO4·5 H2O FeSO4.7H2O 乙二胺四乙酸钠 肌醇（环己六醇） 盐酸硫胺素（维生素B1） 烟酸 甘氨酸 盐酸吡哆醇（维生素B6）
1.3实验材料：烟草细胞
2.实验操作与步骤
2.1计算所配制的各母液成分的需要量（称取量） （1）配制大量元素母液1L (20X)
（2）配制微量元素母液500mL (200X) （3）配制铁盐母液 500mL (200X)
（4）配制有机母液250mL (200X)
2.2植物生长物质母液的配制 2,4–D母液（1mg/mL）：准确称量2,4-D 100mg，先用1～3mL 90%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容；也可以加入少量碱（如1mol/L氢氧化钾、氢氧化钠）溶液，使之中和成为钠盐或钾盐，在水中溶解，再加水定容至100mL，即配成浓度为1mg/mL的母液。
计算出所配培养基所需各种母液的量。（取用量＝需配培养基的体积/母液的扩大倍数）
将所需的各种储存母液按顺序放好，准备好蒸馏水、各种洁净器皿（烧杯、量筒、玻璃棒、可调移液器、枪头）。培养基的成分比较复杂，为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉，可以准备一份配制培养基的成分单，将培养基的全部成分和用量填写清楚。配制时，按表列内容顺序，按项按量称取，就不会出现差错。
按需取各种母液置于500ml烧杯中，加350ml左右的蒸馏水，再加15g蔗糖，加热搅拌溶解。加入0.1ml 1mg/ml的2，4-D，加蒸馏水定容至500ml。
将准备的待灭菌的器皿及培养基放入高压蒸汽灭菌锅内（注意锅中外层的水位适当），在汽相121℃条件下，灭菌20分钟。
灭菌结束后关闭电源，待锅内温度自行下降，压力降至0时，打开排气阀，开盖，取出灭菌物品，置超净工作台或温箱中。
1．接种前，用75％酒精擦拭超净工作台，将培养基和接种用的器具放入超净工作台；打开超净工作台紫外灯，照射20－30分钟后开送风开关，10分钟后可进行无菌操作。
2. 用75％酒精对移液器和手进行表面消毒。
3. 在酒精灯上对装有培养基或培养物的三角瓶或培养皿进行开封，用无菌的移液器取悬浮培养的烟草细胞至不同的新鲜培养基中：10ml悬浮细胞至50ml新鲜液体培养基中；1ml悬浮细胞在无菌EP管中放置、细胞自动下沉后去掉约0.8ml上清液，用移液器取细胞至固体培养基上铺板。将对三角瓶或培养皿进行封口、标记。
4. 培养：
把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120rpm。培养温度为28℃，在黑暗中培养。
培养一周后取出生长良好的细胞悬浮液，在超净台内分装如小培养皿内。轻摇三角瓶后用移液器在每个培养皿内加入900ul细胞悬浮液。分装10个培养皿。 将培养皿摆放好以后打开超净台的紫外灯进行照射，每隔5min取出一个培养皿，加入100ul台盼蓝染液染色3min。用吸管取一滴滴在载玻片上，加盖盖玻片。在显微镜下观察。 ．
5min后镜检结果图
10min后镜检结果图
时间 0min（未照射） 5min 10min 15min 20min 25min 30min 35min 40min
死细胞个数 3 4 3 5 3 3 4 3 4
总细胞个数 76 82 80 78 75 83 78 70 89
细胞死亡率 3.9% 4.9% 3.8% 6.4% 4.0% 3.6% 5.1% 4.2% 4.5%
从实验结果上看，经过不同时间的紫外线照射的烟草悬浮细胞，细胞死亡率都接近于5%，并没有显示出逐渐递增的规律性，说明在该次实验中，烟草悬浮细胞的细胞膜通透性不受改强度的紫外线照射的影响既该强度下的紫外线对植物没有影响。
【参考文献】
1、 植物细胞工程／柳俊,谢从华主编．—2版．—北京：高等教育出版社，2011 2、 植物细胞培养技术与应用／郭勇等编著．—北京：化学工业出版社，2004
3、 紫外辐射／联合国环境规划署等合编；冯军, 曹凤中译．—北京：中国环境科学出版社，
1992.12