1碱性磷酸酶活性520
中国组织工程研究 第18卷 第10期 2014–03–05出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 5, 2014 Vol.18, No.10
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骨髓间充质干细胞的旁分泌能影响成骨细胞生物学功能
李 成,周海斌(苏州大学附属第二医院关节外科,江苏省苏州市 215004)
文章亮点:
1 目前骨髓间充质干细胞作为种子细胞广泛应用于组织工程,然而由于移植部位存在缺血、缺氧和炎症反应,致使骨髓间充质干细胞增殖速度减慢,直接分化效率低下,临床应用受到限制。随着研究的深入,骨髓间充质干细胞的旁分泌作用引起广泛关注。
2 成骨细胞增殖、分化及基质的矿化在新骨形成中起着关键作用。实验选取MG63成骨细胞系为工具细胞,观察骨髓间充质干细胞旁分泌作用对成骨细胞生物学功能的影响,进一步探讨骨髓间充质干细胞在骨修复机制中的作用。
3 实验证实,骨髓间充质干细胞旁分泌作用显著促进成骨细胞增殖与迁徙,同时促进成骨细胞基质成熟与矿化,从多个阶段加强了成骨细胞的成骨能力,为骨髓间充质干细胞临床治疗骨缺损提供一种新思路。 关键词:
干细胞;骨髓干细胞;骨髓间充质干细胞;旁分泌;成骨细胞;增殖;分化;矿化 主题词:
骨髓;间质干细胞;培养基, 条件性;成骨细胞;细胞增殖;细胞分化;细胞迁移分析
李成,男,1987年生,山东省德州市人,汉族,2014年苏州大学毕业,硕士,医师,主要从事骨关节及创伤研究。
通讯作者:周海斌,博士,主任医师,苏州大学附属第二医院关节外科,江苏省苏州市 215004
doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.10.001 [http://www.crter.org]
中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)10-01477-07 稿件接受:2014-01-19
摘要
背景:有研究表明骨髓间充质干细胞移植可促进骨缺损的修复,但受损组织的缺血、缺氧和炎症反应限制了其临床应用。
目的:观察骨髓间充质干细胞旁分泌作用对成骨细胞MG63增殖、迁徙、分化功能的影响。
方法:Ficoll-Paque密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,制备骨髓间充质干细胞条件培养基培养成骨细胞MG63。CCK-8法检测MG63细胞增殖能力变化;细胞划痕法检测MG63细胞迁徙能力变化;微板检测MG63细胞合成碱性磷酸酶能力的变化;Real-time PCR法检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及骨钙素基因表达量的变化;茜素红染色检测其矿化能力的变化。
结果与结论:骨髓间充质干细胞表型为CD44、CD73、CD90表达强阳性,CD34表达阴性。与普通培养基(DMEM)相比,在骨髓间充质干细胞条件培养基作用下,MG63细胞的增殖速度明显加快;细胞划痕结果示其迁徙能力明显提高;诱导第4,7天后碱性磷酸酶基因表达量及蛋白合成量明显增多(P
李成,周海斌. 骨髓间充质干细胞的旁分泌能影响成骨细胞生物学功能[J].中国组织工程研究,2014,18(10): 1477-1483.
Paracrine effects of bone marrow mesenchymal stem cells on biological function of osteoblasts
Li Cheng, Zhou Hai-bin (Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital, Soochow University, Suzhou 215004, Jiangsu Province, China)
Abstract
BACKGROUND: Some studies have shown that bone marrow mesenchymal stem cells have a certain role in the repair of bone defects, but the clinical application is limited because of ischemia, hypoxia and inflammation of injured tissues.
OBJECTIVE: To investigate the paracrine effects of bone marrow mesenchymal stem cells on osteoblast biological function.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated using standard Ficoll-Paquedensity gradient centrifugation. Mesenchymal stem cell conditioned medium was prepared to cultivate osteoblasts, MG63. Proliferation of MG63 cells was analyzed by cell counting kit-8. Migration of MG63 cells was analyzed by cell scratch method. Alkaline phosphatase activity of MG63 cells was analyzed by microplate test kit. Real-time PCR was performed to evaluate osteoblast differentiation markers, alkaline phosphatase, collagen type I and osteocalcin. Alizarin red staining was performed to evaluate osteoblast mineralization.
RESULTS AND CONCLUSION: The cells were strongly positive for CD44, CD73 and CD90, but negative for CD34. MG63 cells cultured in the conditioned medium showed better proliferation and migration than those
cultured in the Dulbecco’s modified Eagle’s medium. The activity and mRNA expression of alkaline phosphatase
Li Cheng, Master, Physician, Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital, Soochow University, Suzhou 215004, Jiangsu Province, China
Corresponding author: Zhou Hai-bin, M.D., Chief physician, Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital, Soochow University, Suzhou 215004, Jiangsu Province, China
Accepted: 2014-01-19
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1477
李成,等. 骨髓间充质干细胞的旁分泌能影响成骨细胞生物学功能 www.CRTER
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were much higher after induction of 4, 7 days (P
Subject headings: bone marrow; mesenchymal stem cells; culture media, conditioned; osteoblasts; cell proliferation; cell differentiation; cell migration assays
Li C, Zhou HB. Paracrine effects of bone marrow mesenchymal stem cells on biological function of osteoblasts. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(10):1477-1483.
0 引言 Introduction
骨髓间充质干细胞是位于骨髓内的一种多能干细胞,具有来源广、易分离、低免疫原性和多向分化潜能等诸多优势,目前在骨组织工程应用广泛。近年来,随着对间充质干细胞研究的逐渐深入,其旁分泌作用已成为关注热点。间充质干细胞能够分泌多种细胞因子和生长因子,如白细胞介素6、转化生长因子β、血小板源性生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、骨形成蛋白、肝细胞生长因子以及血管内皮生长因子等[1-4],这些因子在各种生理活动中扮演着重要的角色,可以调节多种细胞的功能和活性。在骨缺损部位,成骨细胞对微环境因素的变化非常敏感,多种细胞因子和生长因子对成骨细胞的增殖分化有影响[5-8]。本研究重点观察骨髓间充质干细胞条件培养基对成骨细胞增殖、分化、基质成熟的影响以及成骨细胞相关基因表达的变化,进一步探讨间充质干细胞在骨修复机制中的作用,以便为间充质干细胞临床治疗骨缺损提供一种新思路。
实验方法:
骨髓间充质干细胞的分离与培养:无菌条件下行骨髓
穿刺,用肝素化注射器收集骨髓,每份10 mL。等量的1×PBS稀释后沿管壁将骨髓液缓慢加入装有Ficoll-Paque分离液的离心管中,2 000 r/min、离心20 min,吸取界面白膜层细胞,加入培养基,吹打混匀,1 000 r/min、离心 5 min,共洗涤2次。所得单核细胞按1×109 L1细胞浓度接
-
种于10 cm培养皿中。置于含体积分数为5% CO2的37 ℃温箱中培养。3 d后换液,去除非贴壁细胞,以后每隔2 d换液1次。细胞培养基为:DMEM-LG、体积分数为10%胎牛血清、100 U青霉素和链霉素。细胞达到80%融合时,用0.25%胰酶/0.02% EDTA消化2 min,按1∶3传代扩增。
骨髓间充质干细胞表型的流式细胞学分析:当第3代细
胞长至80%融合时,胰酶消化收集骨髓间充质干细胞,1×PBS洗涤后细胞计数,按2×105每管的浓度将细胞加入流式管中,离心后用100 µL的1%牛血清白蛋白(1×PBS配制)重悬,分别加入鼠抗人直标PE或FITC单抗CD34、CD44、CD73、CD90各20 µL,室温避光反应30-60 min,设立阴性对照,1×PBS洗涤3次,并悬浮在450 µL的1×PBS中,流式细胞仪进行检测。
1 材料和方法 Materials and methods
设计:细胞学体外观察实验。
时间及地点:实验于2013年1至10月在苏州大学唐仲英血液研究所实验室完成。
材料:
骨髓间充质干细胞条件培养基制备:复苏第3代骨髓间
待细胞融合度达90%(约充质干细胞于10 cm2细胞培养皿,
2×106)时,细胞换液并弃掉。加入10 mL新鲜DMEM培养基,置于37.5 ℃、体积分数为5%CO2的饱和湿度的培养箱中,培养24 h后收集骨髓间充质干细胞的培养上清,用0.22 μm滤膜过滤上清,分装并冻存于-80 ℃冰箱备用。此培养基定义为100%浓度的骨髓间充质干细胞的条件培养基,实验组采用50%骨髓间充质干细胞条件培养基+50% DMEM培养基。
CCK-8法检测MG63细胞增殖活性:用DMEM-LG(含体积分数为10%胎牛血清)制备MG63细胞悬液,按3×103/孔接种于96孔板,每孔加培养基100 µL,培养12 h后移去培养液,分别加入DMEM、骨髓间充质干细胞条件培养基,每组设6个复孔。分别在第1,3,5天后,每孔加入CCK-8 10 µL,37 ℃反应2 h,吸取黄色上清液于酶标仪450 nm波长处读取吸光度值。
实验细胞:经患者授权同意,抽取苏州大学附属第二
医院骨折患者骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,血液检测肝炎病毒、HIV、梅毒、衣原体等病原学均为阴性。MG63细胞株由苏州大学骨科研究所惠赠。
骨髓间充质干细胞条件培养基制备及成骨细胞生物学功能检测所需主要试剂:试剂
来源 Sigma公司
Ficoll-Paque分离液(密度1.077 g/mL)、 TRIZOL、胰酶
DMEM基础培养基、胎牛血清 流式抗体FITC-CD34,CD73,CD90及 PE-CD44 茜素红
Hyclone公司 美国BD公司
上海国药集团有限公司 南京建成生物公司 CCK8 碧云天公司 Thermo公司
细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒
反转录试剂盒
碱性磷酸酶活性检测试剂盒
细胞迁徙实验:用DMEM-LG(含体积分数为10%胎牛
血清)制备MG63细胞悬液,按1×105/孔接种于6孔板培养
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皿,每孔加培养基2 mL,培养12 h后移去培养液,用1 mL枪尖于每孔中央纵行划痕。对照组加入DMEM-LG(含体积分数为10%胎牛血清)培养,实验组加入骨髓间充质干细胞条件培养基培养,每组设2个复孔,分别于0,12,24和48 h后用相差显微镜拍照,拍照时每孔至少应包括5个不同视野,分析细胞迁徙程度。
主要观察指标:观察矿化沉积及钙化结节(骨化作用沉积过程中无机质)形成情况。
统计学分析:采用SPSS 17.0统计软件包进行分析。实验数据以x±s形式表示,组间比较采用成组t 检验,P
_
碱性磷酸酶活性检测:用DMEM-LG(含体积分数为10%
胎牛血清)制备MG63细胞悬液,细胞以1×105/孔接种于6孔板培养皿,培养12 h后移去培养液。对照组加入DMEM-LG(含体积分数为10%胎牛血清)培养,实验组加入骨髓间充质干细胞条件培养基培养,收集第4,7天的细胞,用1% Triton裂解细胞,2 000 r/min离心5 min,取上清。按试剂盒使用说明处理收集的样本,用酶联免疫检测仪在520 nm波长下测定其吸光度值,BCA法计算出细胞内总蛋白质量浓度,最后按公式计算单位蛋白质量浓度的碱性磷酸酶活性。
2 结果 Results
2.1 骨髓间充质干细胞及MG63细胞形态观察 骨髓间充质干细胞多为长梭形的纤维状,少量为多突起的星形样细胞。细胞折光度好,核仁明显,培养至7 d左右,可见大量的细胞集落形成,细胞形态均一。MG63细胞呈成纤维细胞形贴壁生长,外观呈短梭形、三角形、多边形和鳞片形,折光性强,胞核呈满圆形,位于细胞中央,核质比较大(图1)。
2.2 骨髓间充质干细胞免疫表型分析 培养至第3代的骨髓间充质干细胞表型检测结果显示CD44、CD73、CD90表达强阳性,CD34表达阴性(图1)。
2.3 骨髓间充质干细胞条件培养基对MG63增殖作用的影响 骨髓间充质干细胞的条件培养基培养的MG63细胞,CCK-8法检测结果示其在第1,3,5天的增殖速度明显快于对照组(P
的影响 见图3。相比于对照组,骨髓间充质干细胞条件培养基中的MG63细胞于12 h呈现出一定迁徙能力(图3B和F);实验组的MG63细胞基本合拢,但DMEM培养基中MG63细胞仍存有一定间隙(图3D和H)。提示骨髓间充质干细胞条件培养基可以明显提高MG63细胞的迁徙能力。 2.5 骨髓间充质干细胞条件培养基对MG63细胞分化及矿化能力的影响 分别于DEME培养基和骨髓间充质干细胞条件培养基条件下诱导成骨细胞。碱性磷酸酶活性检测结果显示,在第4,7天时,骨髓间充质干细胞条件培养基诱导组的碱性磷酸酶活性明显高于对照组(P 0.05),但于第7天时骨髓间充质干细胞条件培养基组Ⅰ型胶原表达量升高(P 0.05,图2D),而至第7天时则明显升高(P
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特异性基因的Real-time PCR检测:通过Primer Premier
5 软件设计引物。对照组加入DMEM-LG(含体积分数为10%胎牛血清)培养,实验组加入骨髓间充质干细胞条件培养基培养,收集第4,7天的细胞。采用TRIZOL一步法提取MG63细胞总RNA,取2 μg总RNA,用反转录试剂盒合成cDNA;取1 μL cDNA行Real-time PCR扩增碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原25 μL,双蒸水 10.7 μL,2×mix 12.5 μL,cDNA 模板1 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL。反应参数:总循环数:35 s;延伸:72 ℃ 30 s;最后延伸72 ℃ 10 min。荧光定量PCR仪上机检测(7500,ABI),ABI系统软件分析基因表达量变化。
及骨钙素基因,以β-actin基因为内参引物。反应体系为 2.4 骨髓间充质干细胞条件培养基对MG63细胞迁徙能力
34;预变性:95 ℃ 5 min;变性:95 ℃ 35 s;退火60 ℃ 24 h后MG63细胞的迁徙速度明显加快(图3C和G);48 h后
矿化结节染色:用DMEM-LG(含体积分数为10%胎牛
血清)制备MG63细胞悬液,细胞以1×105/孔接种于6孔板培养皿,培养12 h后移去培养液。对照组加入DMEM-LG(含体积分数为10%胎牛血清)培养,实验组加入骨髓间充质干细胞条件培养基培养,21 d后进行茜素红染色。使用PBS洗涤细胞2次后,经40 g/L多聚甲醛固定10 min,再用去离子水冲洗3次;加入Tris-HCl (pH 8.3)配置的0.1%茜素红,在37 ℃环境下孵育30 min,蒸馏水冲洗,置于光学显微镜下观察。随机选取5个视野照相,采用Image Pro Plus 6.0版专业图像分析软件对图像进行分析。
Real-time PCR实验所用引物:
基因名称 正义序列 反义序列
CTG TTC AGC TCG TAC TGC ATG T ATG TGG TCA GCC AAC TCG TC CAG ACG GGA CAG CAC TCG CC
片段大小 150 bp
碱性磷酸酶 CCT CGT TGA CAC
CTG GAA GA GAG GGC AGC GAG GTA GTG A GTG GAA ACC CGA GCC CTG CC
骨钙素 140 bp
Ⅰ型胶原 129 bp
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C
1.6%
E
96.5%
CD34表达阴性 D
91.6%
F
CD90表达强阳性
98%
CD73表达强阳性 CD44表达强阳性
1 骨髓间充质干细胞和MG63细胞的形态(
标尺为300 μm)以及骨髓间充质干细胞表型的流式细胞学分析 图
Figure 1 The morphology of bone marrow mesenchymal stem cells and MG63 cells (scale bar=300 μm) as well as flow cytometric analysis
of phenotype of bone marrow mesenchymal stem cells
图注:①图中A为骨髓间充质干细胞多呈长梭形的纤维状,少量为多突起的星形样细胞;B
为MG63细胞呈短梭形、三角形、多边形和鳞片形,
折光性强。②图C-F显示骨髓间充质干细胞CD44、CD73、CD90表达强阳性,CD34表达阴性。
A
B
对照组 骨髓间充质干细胞条件培养基组 0.6碱性磷酸酶活性(吸光度)
C
碱性磷酸酶mRNA表达
吸光度值(A)
0.4
0.2
第1天 第3天 第5天
E
4 d 7 d
4
3骨钙素mRNA表达
D
4 d 7 d
Ⅰ型胶原mRNA表达
4 d 7 d
2
1
4 d 7 d
图2 骨髓间充质干细胞条件培养基培养后MG63细胞的增殖能力、碱性磷酸酶活性及特异性基因表达
Figure 2 Proliferation of MG63 cells cultured in the conditioned medium as well as activity of alkaline phosphatase and expression of specific genes
CCK-8法检测结果示其在第1,3,5天的增殖速度明显快于对照组(P
a
细胞生长的作用。②图中B为骨髓间充质干细胞条件培养基诱导组的碱性磷酸酶活性明显高于对照组(P
b
b
b
a
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图3 骨髓间充质干细胞条件培养基对MG63细胞迁徙能力的影响(标尺为300 μm)
E
F
G
H
A
B
C
D
Figure 3 Migration of MG63 cells cultured in the conditioned medium at different times (scale bar=300 μm)
图注:图中A-D为对照组,加DMEM培养基;E-H为实验组,加骨髓间充质干细胞条件培养基。
图4 骨髓间充质干细胞条件培养基对MG63细胞矿化能力的影响(茜素红染色,标尺为300 μm)
C 累积吸光度(×105)
543210
条件培养基组
培养第21天
Mineralization of MG63 cells cultured in the conditioned medium (alizarin red staining, scale bar=300 μm) Figure 4
图注:图中A为对照组,可见少量红色钙化物沉积;B为骨髓间充质干细胞条件培养基诱导组,可见深红色钙化结节,细胞间布满红色颗粒, 提示钙化基质沉积完全;C显示诱导组累积吸光度值明显高于对照组(P
a
3 讨论 Discussion
骨髓间充质干细胞因具有来源广、易分离,低免疫原性和多向分化潜能等诸多优势,广泛应用于骨组织工程,并且在修复骨质和软骨缺损方面显示出良好的应用然而有研究显示将间充质干细胞移植到组织损前景[9-12]。
伤部位后,由于持续的缺血、缺氧和炎症反应,致使间充质干细胞增殖速度减慢,直接分化效率低下,从而使间充质干细胞移植的临床应用受到限制[13-16]。
随着研究的深入,间充质干细胞的旁分泌作用逐渐引起广泛的关注。研究表明骨髓间充质干细胞的旁分泌物质对多种实验性器官和组织创伤模型,如爆发性肝功能衰竭、心肌梗死、急性肾小管损伤和皮肤创伤等,具有较好的促进创伤愈合和功能恢复的治疗效果[17-24]。其作用机制主要是通过抑制细胞死亡,减轻炎症反应,刺激细胞内源性再生的作用,促进细胞分化、增殖而实现对受损组织的修复。
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Parekkadan等[25]还对骨髓间充质干细胞条件培养基进行蛋白组学分析,检测到69种蛋白,其中大部分是细胞因子、生长因子和免疫活性分子。其中一些分子已经证明具有抗凋亡和刺激成骨细胞增殖分化作用,例如白细胞介素6能够促进成骨细胞分化,增加碱性磷酸酶和骨钙素的表达;胰岛素样生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子能刺激成骨细胞增殖和基质合成;血管内皮生长因子能促进成骨细胞增殖、迁移,增强甲状旁腺素刺激的cAMP反应,增加碱性磷酸酶合成;转化生长因子β能够增加成骨前体细胞的增殖、分化能力,促进骨基质蛋白如骨桥蛋白和Ⅰ型胶原的合成[26-37]。
成骨细胞增殖、分化及基质的矿化在新骨形成中起着关键作用。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期标志物,分化早期开始出现,基质成熟期达到高峰;Ⅰ型胶原从增殖期开始表达,基质合成期达到高峰;骨钙素是成骨细胞分
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化后期和矿化期表达的主要蛋白,反映成骨细胞的分化和成熟,一般将碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白作为成骨细胞功能状态的评价指标
[38-41]
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。本研究结果表明,骨髓间
[5]
充质干细胞条件培养基明显促进成骨细胞MG63的增殖和迁徙,有助于成骨细胞从增殖相到分化相的转变;在成骨细胞分化早期即显著增强碱性磷酸酶活性及表达量,随着细胞外基质的成熟,Ⅰ型胶原、骨钙素的基因表达量也较对照组明显增多;在细胞外基质矿化阶段,骨髓间充质干细胞条件培养基诱导的成骨细胞钙结节形成更完整,矿化沉积作用更显著。总之,骨髓间充质干细胞条件培养基旁分泌作用显著促进成骨细胞增殖与迁徙,同时促进成骨细胞基质成熟与矿化,从多个阶段加强了成骨细胞的成骨能力。
骨缺损修复过程受多种体内环境因素的影响,其中包括多种生长因子对细胞分化、发育的调节起协同或制约作用。与体内复杂的内环境相比,单一的生长因子促进组织生长相对不足,多因子协同作用较单个因子更有效[42-44]。本研究证实,骨髓间充质干细胞的旁分泌物质可以显著促进成骨细胞的增殖、迁徙、分化和矿化能力,有望使骨髓间充质干细胞旁分泌作用在骨缺损的临床治疗中发挥更重要的作用。
致谢:感谢唐仲英血液研究所对本实验的技术支持。 作者贡献:实验设计为周海斌和李成,实验实施为李成,实
验评估为周海斌和李成,资料收集为周海斌。李成成文,周海斌审校,周海斌对文章负责。
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利益冲突:文章及内容不涉及相关利益冲突。
伦理要求:抽取苏州大学附属第二医院骨折患者骨髓提取骨
髓间充质干细胞,经患者授权同意。
学术术语:旁分泌-是指具有分泌作用的细胞产生的调节因子
通过细胞间隙对邻近的其他种类细胞起促进作用,这些物质在组织液中扩散,对邻近的组织细胞的功能活动产生影响,使功能活动发生相应的改变。这种功能活动是通过局部体液因素进行的,可以认为是局部性体液调节,又称为旁分泌调节。
作者声明:文章为原创作品,无抄袭剽窃,无泄密及署名和
专利争议,内容及数据真实,文责自负。
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