微生物菌剂中5种芽孢杆菌实时荧光PCR鉴定

246中国卫生检验杂志2010年2月第20卷第2期　Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Feb 2010; Vol 20　No 2

【论著】

微生物菌剂中5种芽孢杆菌实时荧光PCR 鉴定

程琳琳, 王芳

1

23

, 吴琼, 金莉莉, 王秋雨

1113

(11辽宁大学生命科学院, 沈阳　110036; 21沈阳出入境检验检疫局, 沈阳　110016)

[摘要]　目的:建立一种快速、准确鉴定环保微生物菌剂中常用5种芽孢杆菌的方法。方法:根据r poB 和gyr B 基因序列

分别设计扩增5种菌的特异性引物及Taq man 探针, 并进行反应条件优化。结果:5种芽孢杆菌均产生特异扩增信号, 最

低检出浓度为:枯草芽孢杆菌24cfu /ml 、地衣芽孢杆菌35cfu /ml 、巨大芽孢杆菌50cfu /ml 、短小芽孢杆菌41cfu /ml 、环状芽孢杆菌21cfu /ml 。结论:研究建立的实时荧光PCR 鉴定方法具有良好的重复性和准确性, 可用于微生物菌剂中5种常用芽孢杆菌的快速鉴定, 具有很好的推广应用前景。[关键词]　微生物菌剂; 芽孢杆菌; 实时荧光PCR; 鉴定

[中图分类号]　R44615　　　　[文献标识码]　A 　　　　[文章编号]　1004-8685(2010) -04

I den ti f i ca ti on of f i ve B ac illus species used i n env i i a ith rea l -ti m e PCR

CHEN G L in 2lin , WAN G Fang

1

23

, Q , J I N L i 2li iu 2yu

113

(11L ife School of L iaoning 21Shenyang Entry -Exit I ns pecti on And Quarantine Bureau, Shenyang 110016, )

[Abstract]　O T o establish a rap id and accurate method t o identify the five B acillus species generally used in envir on ment m icr obe agentia 1M ethods:By analyzing nucleotide sequences of r po B and gyr B genes, the s pecies -s pecific p ri m ers and p r obes were designed and the reacti on conditi ons were op ti m ized in this research 1Results:The result sho wed that all five s pecies generated a s pecific a mp lificati on signal 1The detecti on li m it of B 1subtilis , B 1lichenifor m is , B 1m egaterium , B 1pum ilus and B 1circulans was 24, 35, 50, 41and 21cfu /ml, res pectively 1Conclusi on:The s pecific real -ti m e PCR method established in this study has g ood re 2peatability and accuracy, and has very g ood p r os pects f or the app licati on in rap id identificati on of these B acillus species 1[Key words]　M icr obe agentia; B acillus ; Real ti m e PCR; I dentificati on

　　芽孢杆菌属中枯草芽孢杆菌(B acillus subtilis ) 、地衣芽孢杆菌(B acillus lichenifor m is ) 、巨大芽孢杆菌(B acillus m egateri 2um ) 、短小芽孢杆菌(B acillus pum ilus ) 、环状芽孢杆菌(B acillus circulans ) 由于能产生多种酶、细菌素、肽类抗生素等物质, 其细胞壁的肽聚糖以及糖被又是重金属的主要螯合位, 能够吸附金属阳离子, 已作为微生物菌剂广泛应用于污水处理、植物病害防治和饲料添加剂中。

中国每年有大量上述菌剂进口, 准确鉴别各种菌剂的成分是产品检测和质量判定的依据。传统的生理生化方法不仅耗时费力, 且容易出现差错, 因此不能满足大量进境微生物菌剂的检测需要。曹凤明等采用多重PCR 鉴定枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌, 但短小芽孢杆菌引物与巨大芽孢杆菌和环状芽孢杆菌有交叉反应[1], 本实验室用PCR 法鉴

[基金项目]　沈阳市科技局2006年沈阳大型科学仪器设备共享

定这5种芽孢杆菌, 虽然引物特异性高, 但检测的灵敏性不理

想, 且只能进行定性检测(未发表) 。

1992年H iguchi 提出了实时PCR 的设想, 1996年美国Ap 2p lied B i osyste m s 公司研究出实时荧光定量PCR 技术。该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃, 而且不需要PCR 后处理, 避免了交叉污染, 整个PCR 过程实现了自动化, 且具有耗时短、特异性高、灵敏性强、易于标准化和推广应用等特点。实时荧光定量PCR 技术已在医学、检验检疫、军事、农业、科研

[2]

等领域得到了广泛应用。国外学者已将该技术应用于芽孢杆菌的检测和监控, 如对地毯、土壤、奶粉、明胶等不同环境中的芽孢杆菌进行定量检测。而在国内, 仅见到应用该技术检测蜡样芽孢杆菌的报道[3]。本文以r poB (DNA 依赖的RNA 聚合酶β亚单位) 、gyr B (DNA 促旋酶B 亚单位) 基因序列分别设计得到了特异性引物与Taq man 探针, 建立了使用实时荧光PCR 技术定性定量鉴定5种芽孢杆菌的方法。

1　材料与方法111　材料

11111　菌株　表1为菌株的编号及来源; 所有菌株均采用营

服务专项基金(F136-2)

[作者简介]　程琳琳(1983-) , 女, 硕士研究生, 主要从事微生物

学研究。

3通讯联系人, E -mail:qiuyuwang@lnu 1edu 1cn, wangfang@ln 2

ciq 1gov 1cn

养琼脂平板划线分离与纯化。

中国卫生检验杂志2010年2月第20卷第2期　Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Feb 2010; Vol 20　No 2

T M

11112　主要试剂和仪器　Pre m ix Ex Taq (2×) (Code DRR039A ) 购自宝生物工程(大连) 有限公司, 细菌基因组

247

表2　引物与探针序列

Bacteria B 1subtilis

) Pri m er and probe sequences (5′→3′F2480:GCGG AATCATCCGT ATTGGGGCAG A R2616:AACCTCGCGGGCTTTCTCGCCAA Pb2553:AACTG AACTG ACTGCCG AAG AACGCCT

Gene

DNA 提取试剂盒(离心柱型, 目录号:DP302) 购自天根生化科

技(北京) 有限公司, 荧光PCR 八联管及管盖购自美国伯乐公

司, 细菌微量系列化鉴定管购自北京陆桥技术有限责任公司。荧光PCR 仪(美国MJ 公司, OPTI C ON ) 。

B 1lichenifor m is

rpoB

F460:AAAGCTG ATTTG AAAGTCATTGG AG AT R577:G AGTGGCG AGCGT ATCAT AGTC Pb496:ACGGG AACG ACCACACACTTCAAGCCT

gyr B

表1　实验用菌株

Strains

B acillus subtilis

Strain No 1and source a

ACCC10243、SYCI Q Z0610009、SYCI Q Z0703152、SYCI Q -Z0707199、SYC I Q Z0707203

ACCC10236、SYCI Q Z0608179-1-2、SYC I Q Z0703148、SYC I Q Z0707197、SYC I Q Z0707200

ACCC10245、SYC I Q Z0703151、SYCI Q Z0706068、SY 2C I Q Z0706071、SYC I Q Z0707069-1

ACCC10239、SYC I Q Z0609070、SYCI Q Z0610006、SY 2C I Q Z0703150、SYC I Q Z0707198

ACCC10228、SYCI Q Z0703154、SYCI Q Z0707205ACCC10225ACCC10227ACCC10226I Q SYC I Q 44106-2、LNC I Q O157:H7ATCC17802、C MCC86-87SYC I Q 54001SYC I Q 07011202

B 1circulans B 1pum ilus B 1m egaterium

F486:TGCT AG AGCTTCATTT AGGT ATGGC R625:T AG AACTGTTTT AGCATCACG AG AC Pb519:AGCTTGGCATTCACGTTGCGTCTCCAG F3202:GGCGGT AAAGCACAGTTTGG R3282:TGTGT Pb3229:ATGGGCA F986:R1151:ATT AG ATCGTCATTTCCAAGC

gyr B rpoB rpoB

B acillus lichenifor m is

B acillus m egaterium

B acillus pum ilus B acillus circulans B acillus am yloliquefaciens B acillus chitinolyticus B acillus azotofor m ans B acillus cereus B acillus sphaericus Sal m onella choleraesuis Escherichia coli V ibrio parahae m olyticus L isteria m onocytogenes S taphylococcus aureus

　　注:a:ACCC:Agricultural Culture Collection of China; SYC I Q :Shenyang Entry -Exit

Inspection And Quarantine Bureau; LNC I Q :Liaoning Entry -Exit Inspection And Quarantine Bureau; ATCC:American Type Culture Collection; C MCC:National Center For Medical Culture Collections

015μl, 3μmol/L荧光探针溶液1μl, DNA 模板约

50ng 左右, 加无菌超纯水补足至25μl 。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌荧光PCR 反应条件:第一个循环为50℃2m in; 95℃10m in; 后39个循环为95℃15s; 58℃30s; p late read 。巨大芽孢杆菌的荧光PCR 反应条件:第一个循环为50℃2m in; 95℃10m in; 后39个循环为95℃15s; 70℃30s; p late read 。11214　结果判定　(1) 循环阈值(cycle threshold, Ct 值) ≤35, 表明PCR 过程中有目标DNA 的扩增, 并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常, 可直接判定为阳性; (2) 待检样基因检测Ct 值在36～40之间, 应重做实时荧光PCR 扩增; 再次扩增后的外源基因Ct 值仍>36, 且曲线有明显的对数增长期, 并且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常, 则可判定为阳性; (3) 再次扩增后外源基因Ct 值>40, 且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常, 可判定为阴性。

11215　实时荧光PCR 的特异性实验　分别以各引物对和探

112　方法

11211　菌株基因组DNA 的制备　挑取平板上单个菌落, 接种

于营养肉汤, 160r/min 振荡培养过夜, 地衣芽孢杆菌30℃培

养, 其它菌株37℃培养, 按细菌基因组DNA 提取试剂盒操作说明提取各菌株的基因组DNA, -20℃冻存备用。11212　引物和探针的设计　使用软件p ri m er510设计引物和探针, 将每条引物和探针在互联网上(htt p://www 1ncbi 1nl m 1cih 1gov/BLAST) 进行比对, 保证其在种内通用、种间特异。表2为各引物和探针序列, 引物和探针由上海英骏生物技术有限公司合成, 其中探针的5′端标记F AM , 3′端标记T AMRA 。11213　荧光PCR 反应体系及程序　以菌株的基因组DNA 为模板, 利用设计好的种特异性引物与探针进行PCR 扩增。反

) 1215μl, 20μmol/L应总体系为25μl, 包括Pre mix Ex Taq T M (2×

针在各自的反应条件下扩增全部35株参考菌株并设空白对

照。

11216　实时荧光PCR 灵敏性实验　将标准菌株B 1subtilis 10243, B 1lichenifor m is 10236, B 1m egaterium 10245, B 1pum ilus

n

10239, B 1circulans 10228的菌液作10倍比稀释后, 各取1m l 提取基因组DNA, 进行荧光PCR 检测, 同时取适当稀释度的菌液进行平板计数。同时以Ct 值为横坐标, 菌液浓度的对数值为纵坐标制作标准曲线, 以得到线性回归方程, Ct 值与细胞量是对应的, 对于未知量样品可以通过标准曲线来定量检测。11217　实时荧光PCR 技术对送检菌剂的检测　采用实时荧光PCR 方法与常规生化方法[4, 5]同时对送检菌剂Z0802033、Z0802034、Z0802035、Z0802036、Z0802037、Z0803155、Z0803156进行检测, 考察其在菌剂检测应用中的可行性。

2482　结果

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211　实时荧光PCR 特异性实验结果

图1显示了实时荧光PCR 特异性实验结果, 5种芽孢杆菌在特异的引物和探针下均得到了扩增, 而所有其它对照芽孢杆菌及非芽孢杆菌均没有检测到荧光信号, 说明所设计的引物和探针具有很好的特异性

。

A:B 1subtilis 10243; B:B 1lichenifor m is 10236;

C:B 1m egaterium 10245; D:B 1pum ilus 10239; E:B 1circulans 10228

图3　荧光PCR 定量标准曲线

213　送检菌剂的检测鉴定结果

A:B 1subtilis 10243、Z0610009、Z0703152、Z0707199、Z0707203; B:B 1lichenifor m is 10236、Z0608179-1-2、Z0703148、Z0707197、Z0707200; C:B 1m egaterium 10245、Z0703151、Z0706068、Z0707069-1; D:B 1pum ilus 10239、Z0609070、Z0703150、Z0707198; E:B 1circulans 经过菌落形态、菌体特征及生化实验等表型特征的测定,

送检菌剂Z0802035、Z0802037为枯芽孢杆菌; Z0802034、Z0803155为地衣芽孢杆菌; 菌剂为巨大芽孢杆菌; Z0802033、PCR 的, 图1　荧光PCR 212　实时荧光图2, 枯草芽孢杆菌检

出的最低浓度为24/m地衣芽孢杆菌检出的最低浓度为35cfu /ml, 巨大芽孢杆菌检出的最低浓度为50cfu /ml, 短小芽孢杆菌检出的最低浓度为41cfu /ml, 环状芽孢杆菌检出的最低浓度为21cfu /ml 。标准曲线见图3

。

A:concentrati on of B 1subtilis 10243(left t o right, cfu /ml ) 21355×107, 21355×106, 21355×105, 21355×104, 21355×103, 21355×102, 21355×101; B:concentrati on of B 1lichenifor m is 10236(left t o right, cfu /ml) 31485×107, 31485×106, 31485×105, 31485×104, 31485×103, 31485×102, 31485×101; C:concentrati on of B 1m egateriu m 10245(left t o right, cfu /ml ) 41950×106, 41950×105, 41950×104, 41950×103, 41950×102, 41950×101; D:concentrati on of B 1pum ilus 10239(left t o right, cfu /ml ) 41060×106, 41060×105, 41060×104, 41060×103, 41060×102, 41060×101; E:concentrati on of

B 1circulans 10228(left t o right, cfu /ml ) 21120×106, 21120×105,

21120×104, 21120×103, 21120×102, 21120×101

图2　荧光PCR

灵敏性实验结果

素有“细菌化石”之称的16S r DNA 基因几乎可以对所有

的细菌进行属水平上的鉴定, 是细菌分类学的“分子钟”。由于枯草芽孢杆菌近缘种16S r DNA 序列的相似性在9811%～9918%之间, 并且芽孢杆菌16S r DNA 基因为多拷贝基因, 不同拷贝具有异质性, 根据其序列难以区分这些近缘种[6]。细菌DNA 促旋酶(gyrase ) 由两个亚单位组成:Gyr B 和Gyr A 。该酶的活性结构是由2个A 亚基和2个B 亚基组成的四聚体, 即(BA ) 2, 其中B 亚基由基因gyr B 编码, 分子量约90k Da 或者70k Da 。gyr B 基因是单拷贝的看家基因, 序列长度约112～114kb, 平均碱基替换率为每100万年变化017%～018%, 比

[7]

16S r DNA 的每5000万年变化1%的速率要快, 枯草芽孢杆菌近缘种gyr B 基因的相似性在7514%～9510%之间, 理论上可作为区分芽孢杆菌的靶基因。本文利用gyr B 基因设计5种芽孢杆菌的特异性引物, 仅地衣芽孢杆菌与环状芽孢杆菌较理想, 枯草芽孢杆菌与短小芽孢杆菌的扩增结果不理想, 而目前Gen Bank 中没有巨大芽孢杆菌gyr B 基因序列。r poB (DNA 依赖的RNA 聚合酶β亚单位) 基因也常用于特异性细菌的分子分类研究[8], 经过筛选与分析, 本文利用r poB 基因设计了枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌与短小芽孢杆菌的种特异性引物。

本文以r poB 、gyr B 基因序列分别设计5种菌的特异性引物与Taq man 探针, 与对应菌均可产生特异扩增信号, 其它对照的芽孢杆菌及非芽孢杆菌无信号反应, 具有很高的特异性。对送检样品进行的实时荧光PCR 鉴定结果与常规理化方法一致, 表明本文建立的实时荧光PCR 方法具有很好的准确性和实用性。最低检出浓度显示该方法的灵敏性良好。根据定量标准曲线, 相关系数R 值越接近1100, 曲线越可信[9], 本实验所得R 2均大于01979, 可以认为相关性良好。

本文所建立的实时荧光定量PCR 鉴定方法与传统理化方法及PCR 方法相比, 操作简单、特异性好、灵敏性高、报告周期短, 同时可以进行定量分析。此方法适用于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌的快

(下转第296页)

296中国卫生检验杂志2010年2月第20卷第2期　Chinese Journal of Health Laborat ory Technol ogy, Feb 2010; Vol 20　No 2

-同。经实验, 以30mmol/LK OH 为淋洗液, 与常见F -、Cl 、

-2---NO 3、S O 4、NO 2、B r 等阴离子有较好的分离。流速对分离度影响不大, 一般情况下流速与淋洗出峰时间成正比, 流速增大, 保留时间明显缩短, 但系统压力会升高, 流速的增加受分离柱最大操作压力的限制; 另一方面, 流速减小, 保留时间会增大, 而且峰形会变宽。综合考虑系统压力和保留时间的影响, 选用112m l/min 流速

。

　　在生活饮用水空白样品中添加不同含量的3个水平2, 4-滴和灭草松混合标准溶液, 每个添加浓度平行测定6次, 测定精密度, 结果见表1。加标回收率为9514%～10411%, 所测定的RSD 在1108%～2104%之间。

表1　水样的加标回收率及相对标准偏差试验(n =6) 水样

2, 4-滴

本底

(mg/L) ND

添加浓度

(μg/L)

30100500

回收率

(%) [***********]991416

相对标准偏差

RSD (%)

[***********]251146

苯达松ND 1005001000

3　小结

、4-。采用离子色谱、灵敏度、精密度和准确度均(G B 5749-2006) 。

[参考文献]

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[4]新增饮用水水质标准检测技术研究检测方法汇编1国家城市供水

将2, 4-滴和灭草松混合标准溶液取500μl 注入I C, 以除草剂峰面积为纵坐标, 以浓度为横坐标, 二种除草剂分别在30～1000μg/L和100～1000μg/L的线性范围内呈良好的线性关系, 二种除草剂的线性相关系数在019991～019998之间。2, 4-滴的检出限为01010mg/L,定量限为0103mg/L,灭草松的检出限为010300mg/L,定量限为0110mg/L, 可以满足生活饮用水水质检测需求。213　方法的精密度和准确度试验

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(上接第248页)

速鉴定, 能满足检疫部门快速、准确检验相关菌剂的需求, 具有很好的推广应用前景。

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