接骨草蔗糖酶同工酶的分离纯化及其部分性质研究_褚波
第
卷
第
期
西 南 师 范 大 学 学 报
自然 科 学 版
过 i
a
年 司 翻c
月
a
文 章 绷号
一
h
h ia
a
一
一
接 骨草 蔗糖酶同工酶 的 分 离 纯 化 及 其 部分 性 质 研 究
褚
①
波
,
武 忠亮
,
,
`
唐云 明
4 00 71 5
西 南 大 学 生 命科 学 学 院
重庆
摘要
:
从 接 骨 草 幼 叶 中提 取 的 蔗 精 酶 粗醉 液 经 硫 酸 铰 分 级 沉 淀
,
、
DEA
De S
ph
r o a s
e
离 子 交换层析
、
S e
,
ph
c y a r
1S 2
0
凝 脸 过 滤层 析 纯 化
得到
.
3
种 同 工醉
,
.
.
对
,
3
种 同工 酶 进 行
SD S P A G E 和
.
E I
p H
F 3
电 泳 均 显示 一 条 蛋 白 带
.
其 亚基分子
t 分别 为
57; 2 m m
o
45
.
8 K D 4 4 3 K D 43
.
,
2 KD
.
等 电 点 分别 为
,
p H 4
0 p H
,
3
.
8
,
75
.
凝胶过滤测 得
,
3
种 同工 酶 全 酶 分
,
子 量 分别 为 9 1
l/ L
,
2 K D
,
9 8
o
.
1 K D
;
,
7 8
a x
.
4 K D
表明
9 8 产g
3
种同工酶均由
n
,
2
n
,
个相同亚基组成
3 5 拜g
其表观
K m
l /L 分别为 3 0 mmo
p H 4 4
.
.
6 5 m m l/ L
,
V m
分别 为
9~ 4
.
/mi
4 8 拌g
.
/mi
/mi
n
.
同 工 酶 I 和 同工 酶 班 在
范 围 内 比较 稳 定
.
一5 0
时 有最 大 活 性
同 工 酶 n 则在
p H3
,
2
时有 最 大 活 性
;
3
种 同 工 酶均 在
.
p H 3一 6
同工 酶 I 和 同
.
工 酶 1在 4 8 一5 2 ℃ 有 最 大 活性 关
同工 酶 m 在 5 0 ~ 5 ℃ 有 最 大活 性
性质
3
种 同 工 酶 均在 5 0 ℃ 以 下 有 较 好 的 稳 定性
健
词
:
接 骨 草 叶 片 ; 蔗 糖 酶 ; 同工 酶 ; 分 离 纯 化
口 洲
中圈 分 类 号
:
肠
,
文 献标识码
:
A
蔗 糖 酶 主 要 存 在 于 植 物 的幼 嫩 组 织 中
,
其 活 性 随 着 植 物 的 生 长 以 及 组 织 中蔗 糖 含 量 的 升 高 而 降 低
,
.
.
蔗
’
.
糖 酶 参 与 了 植 物 的 蔗 糖代 谢 渗 透 调 节 创 伤 愈 合 对 病 原 体 人 侵 作 出 反 应 等 生 理 过 程
,
动物 中 蔗糖 酶 主
`
、
要存 在于消 化道 中
,
是 一 种非 常 重 要 的 消 化 酶
,
,
在 碳水 化 合 物 的 消 化 吸 收 过 程 中起 着 非 常 重 要 的 作 用 「
,
蔗 糖 酶 的缺 乏 将 导 致 消 化 不 良
腹泻等症状
,
.
食 品工 业 中
[ j 可 以 将 蔗 糖 酶 固定 到 高 岭 石 2
、
海藻酸钙凝
.
胶阁 外
,
、
聚丙烯 酞胺凝 胶川 等 载体 卜 提 高其 稳定 性 后用 于 果 糖
,
低 聚果 糖
.
、
果 葡糖 浆 等 甜 味 剂 的 生 产
此
作为一 种消化 酶 接 骨草
,
有 望 和 蛋 白酶
,
、
脂 肪 酶 等 酶 一 起 成 为 药用 酶 类
,
又 名 臭草
是 一 种 繁 殖 迅 速 非 常 普 遍 的 草 本植 物
,
目前 国 内外 还 没 有接 骨 草 蔗 糖 酶 相 关 研 究
,
.
鉴 于 蔗 糖 酶 在 动 植 物 中 的重 要 生 理作 用 以 及 在 工 业 生 产
上 的 经 济 价 值
本研 究 以 接 骨 草 为 材 料
,
从 其叶 片
中分离纯 化 了 蔗糖酶
一些理论 依据
.
,
并 对 酶 的一 般 性 质 作 了 研 究
以 期 为 蔗 糖酶 的 进 一 步 开 发 利 用 提 供 一 种 新 的 酶 凉 和
1
1
.
材 料 和 方法
1
材 接骨草 (
料
S a m bu c u s
。
5 从、 。 1
L i
n
l ) 叶 片于 2 0 0 3 年 3 月 下 d
.
旬至
4
月 上旬 采集
,
,
气温 2 0
℃左右
,
.
选用 植
株 中的幼嫩 叶 片
以 下 实验
.
( l
一
4
展 开叶 为实验材 料
)
称质量 后
,
先 用 自来 水 洗 净
然 后用 蒸馏 水 冲洗
擦 干 后进 行
①
收稿 日 期 基金项 目 作者简介
通 讯 作者
: :
:
200 4
一
4
12
~
呢
,
:
重 庆 市科 委 资 助 项 目 C S T C
加旧
、` !
,
、
扩 1
12
,
褚
波(
,
19
8门
一
)
男
,
四 川绵 竹 人
硕 卜研 究 生
上要
从 事 生 物化 学 与 分 子 生 物 学 研 究
唐云 明
教授
.
第6 期
1
.
褚
波
,
等
:
接 骨 草蔗 糖 酶 同 工 酶 的 分 离 纯 化 及 其 部 分 性 质 研 究
1117
2
粗醉 制 备 与 纯 化 称取
20
9
一
接骨 草 叶 片
,
剪碎
,
,
在 高速 组 织 捣 碎 机 中
,
,
按 每 克 叶 片 2 m L 缓 冲液 的 比 例 加 人 预 冷 的
.
0
.
.
5 0 收
mo l / L 的 磷 酸 柠檬 酸 缓 冲 液
充分 捣 碎
,
冰浴 中提取 4 0
Z h
, ,
mi n n / mi r
,
然 后在
,
4 ℃
、
8 00
,
n r / mi
,
,
离心 3 0
L
mi n
集上 清液
,
,
加 人硫 酸 按 至 3 0 % 饱和 度
,
沉淀
8 00
离心 3 0
.
mi n
收集 上 清
再 加 人硫 酸 按 至
酶 提 取缓 冲
.
0 %饱 和度 7
1 3
.
沉淀
2 h
.
再在
4
℃
、
8 00
n / mi r
n 离心 3 0 mi
.
收 集 沉淀
0 m 将 沉 淀溶 解 于 6
2 液 中 对同样 的 缓 冲 液 进 行 透析 1
D EAE
.
h
除 去 硫酸 按
.
透析 后 的 粗 酶 液 用 下 述 两 步 法 进 行 纯 化
.
琼 脂精 柱层 析
6
c
DEAE
一
琼脂 糖 按产 品说 明 书 要 求 处 理 装 柱 后 层 析 柱 ( 2
5
m X 1 3
c
m )用 o
a
.
l /L 5 mo 0
.
,
p H S
.
0
的 磷酸
一
.
柠 檬 酸 缓 冲液 平 衡
,
0 个 床体 积 每 次 上 样 量 为 1
,
.
m L
5
.
.
用
。~ 1 m o l
/
,
L N
.
I 溶液 ( 含 0 0 C 5
,
ml o / L 的磷 酸 柠
5 mL
檬 酸 缓 冲液
.
E D T A 和 琉基 乙 醇各 1 m m o l /L
.
p H
) 进 行 线 性 洗脱 0
流速 3 0 m L /h
每管 收 集
.
测
定 每管 中 的 蛋 白含 量 和 蔗 糖 酶 活 性
1 4
将 活 性 较 高的 各 管 洗 脱 液 集 中
.
透 析 脱 盐 后 进 行冷 冻 干 燥
,
S ph
e
ae
r l 导 2 0 0 凝 胶层 析 y
5 2 0
0
S e
液 (p H
0
.
ph r y l a e
1 凝 胶按 产 品 说 明 书 要 求 装 柱 (
. .
6
c
m X 8 0
c
m )后
用
,
0
.
5 0
m o l / L 的磷 酸
,
`
柠檬 酸 缓 冲
3 mL
.
5
.
) 平 衡 3 个 床 体积 0
0
将 上 一 步 骤 所 得 的 蔗
糖 酶 用 同样 的 缓 冲 液 溶 解 后 上 柱
5 0
.
.
上 样体 积
. .
以
,
1
o m
/ L 的 Na l C I 溶液 ( 含
o m
l/ L 的磷 酸 柠 檬 酸 缓 冲液
一
,
p H 5
,
.
) 洗脱 0
流速 3 0 mL / h
每管 收 集
5 mL
并 测 定 其 蛋 白含 量 和 蔗 糖 酶 活性
酶 用 于 电 泳 以及 基 本 性质 测 定
1 5
.
将 活 性 较 高 的 各管 洗 脱 液 集 中 透 析 脱盐 后 冷冻 干 燥
得 到 纯 化 好 的蔗 糖
醉活性 测定
参照
1 6
.
D N S
法闭 进行酶 活测定
.
.
酶 活 单位 定 义
:
0 ℃ 3
、
p
H S
条件 下
,
每 分钟 催 化 产 生
1 拌m o l
葡萄 糖所
需 的酶 量 为 一 个 酶 活 单 位 ( U )
蛋 白质含 t 测定
采用 B a r d f o r d 法困
1 7
.
,
以 牛 血 清 白 蛋 白为 标 准 样 品
.
分子 t 的测 定 亚 基分 子 量 测 定 采 用 s D s
P A GE
法川 进 行
.
;
] [ 全 酶 分 子 量 测 定 采 用 凝胶 过 滤 法 s
.
1 8
.
等点 的 测 定 等 电 点 的 测 定 采 用 等 点 聚 焦 的 方法 阁 进 行
主 要 化 学 试荆 及 仪 器
D EAE
一
1
.
,
琼脂 糖 (
a
D E A E Se p h
“ r
一
a r o s e ” r
Fa
s
t
F lo w )
;
,
Se ph
a e r
y l S 200
一
凝胶
,
等 电点 标 准 品
,
蓝 色葡 聚 糖 2 0 0 0
;
和 载 体 两 性 电解 质 为 A m
s h
a
m Ph
m臀 ia 产 品
.
丙 烯酞 胺 和 甲叉丙 烯 酞胺 为 S e r v a 产品
SD S P A G E
标
准品 为 Po r mg e
产品
n
;
其 他 试 剂 为 国 产 分析 纯
a r
L K 珍柱 层 析 系 统 为 Ph
m
a e
ia
产品
;
F 20 S
冷冻
、、 一U ǎ C 什 `n é 0J U
干 燥仪 为 日本 i N o b
产品
一
;
L S一
0 M 超速离心机 为 8
o一 a
k e Bc 产品
产品
m
;
;
a n 产品
Mi
n
一
;
DY Y n
in 3
s
型 电 泳 仪为 北 京 六 一 仪 器 厂
te
1 妇 任 、
阳 扭 喇 如 誉
·
1 8 6
-. .
、 · I. · 2 刁 峨 0 3 1
1
ip r
o te
y
s
m 型 电泳槽 为 B i
R d
公司
.
、 加 ` 、、 t,
L
划 鹅 之
· 1 1 净 占 0 4
,
U V
2100
n c 型分 光光度计 为 U i o 公 司 产品
号 一 管多 一 卜
O2
.
一
\ 印 山 、
,J. J. . 目 .1 .S 、 Z 0D 0 1一 山 、 口 尸 . 0 6 1
.
·
邑
2
2
.
结
1
果
,
0 0
0
蔗据 陇的分 离纯化
从 接 骨 草 叶 片 中提 取 的 粗 酶 液 经 硫 酸 铁 盐 析 后
过 图
D E A E Se p h l
一
1
.
同工 酶 工 ;
2
.
同工 醉 1
;
3
.
同工醉 m
p ha r
.
a r o s e
Fa
一
s t
F lo w 柱 层 析 分 离
r o s e
,
结果如
图 1
F ig
.
接 骨 草 叶 片蔗 糖 酶 的
1
D EA
De S
is
s o
e
柱层析
ta s e
所示
0
.
将 D EA E Se p h a
,
F
a s
t
F lo w
柱层析分
l
C o lu m
e a v e s
n
C hr o m
a
to g r a Ph y o
f In
v e r
离 得 到 的三 种 蔗 糖 酶 同 工 酶 透 析 干 燥 后 过 S e c y r P ha
5 2 0
in L
o
f Sa m bu
一
c u s c e
hi
n e n s
L in d l
o n
凝胶 柱
结 果如 图
2
所示
.
D EA E S Ph
a r o s e
1 1 18
西 南师 范 大 学学报 ( 自然 科 学 版 )
一
第
,
30
卷
纯化后 的蔗糖 酶同工 酶经 S D S 同工 酶 已 达 到 电 泳 纯
。 劝 必 燃 断 墩
.
PA G E 1
.
与 I E
F
电泳后 均 显示 一 条蛋 白带
说 明纯 化 后 的接骨 草 蔗糖 酶
纯 化 结果 见 表
加 刃 幻 0。 8 o c
版 划 之
划 鹅 之
幽 扭 和 喇
】 O
八
r o u e
~山 灿 月
印
0 3
管号
0 4
筋 岌
0 。 .
叭
a e r
阴 训 扭 和 遏
·
20 4 6 0 8
版 划 之
) 同 工 醉 I 的凝胶过 滤图 形 ( a 图 2
F ig 2
.
管号 伪) 同工 醉 n 的凝胶 过 油图 形
ro s e
) ( c
c r
U凝 胶过滤 圈形 同工 醉的 】
经 D E A E Se pha
G l F
e
一
柱 层 析 分 离 的 蔗 糖 醉 同 工醉 的 S e p h a
r n s
y l
5 2 0 0 凝 胶过 滤 图形
n v e r t a s e
ilt r a t
i
o n
P
a
t te
T h
e
gh S ph
o
y l
n
5 20 0 C l m
Ch
ro
o
u
n
o
f I
S
e
pa
r a
te
d by
DEAE S ph
a r o s e
C l m
u
m
a
to g
r a
phy
表
T
a
1
接 骨 草 叶 片 蔗 精酶 的 纯 化 步 骤
o
bl
e
l
St e
p
s
o
f P
u r
ifie a t io n
f In
v e r
t a s e
fr
o
m
a S
m bu
·
c u s c
hi
n e n s
`5
L in dl
步 粗 酶液
骤
同工 酶
总蛋 白/ m g
13 7 66 1
.
总活力 / l U
1 850 1 66 5 592
336
.
比活 / u
13 24
.
m g一,
纯 化 倍数
回 收率 / %
100
50 90
硫酸氨盐析
阴 离子 交 换
7 248 804 76 7 17
11 09
.
1 31
.
85
4
90
.
1 7
.
4 24
4 18
.
.
28 6
.
.
DEA E
0 0
0
.
.
8
.
31 02
.
18 2
14
山
.
.
264
5
.
344 1 16 1 1 42 9
9
.
25 6 86
.
.
3
.
19 7 9 5 15 7 2 5 140
.
.
8 5
05
孟 百 ` 六 ù ,
己 n
凝胶过滤
0 0
.
.
10 5 8 9 1 15
.
.
.
6
1 56 2 2
.
72
…
,
2 2
.
全 醉分 子 . 及 亚 基 分 子 , 测 定
a r 采 用 S即 h e
yl
5 2 0 凝 胶 过 滤 法 (图 3 ) 测得 同工 酶 工全 酶 分 子 量 为 9 1
4)
,
.
2 K D
,
经 S D S 聚丙 烯 酞 胺 凝
.
胶 电 泳 显 示 一 条 蛋 白带 ( 图
5 其亚 基 分 子 量 为 4
, ,
.
8 K D
.
;
9 同工 酶 n 全 酶 分 子 量 为 8
;
1 K D
.
经 S D S 聚丙
,
烯 酞 胺 凝 胶 电 泳 显 示 一 条 蛋 白带
其亚 基 分 子 量 为 4
3 K D
.
同 工 酶 1 全 酶分 子 量 为 8 7
D .
4 K D
经 SD S 聚
丙 烯 酞 胺凝 胶 电泳 显 示 一 条 蛋 白带
其 亚基分 子量 为 4 3
2 K
阮
1
.
:
\ \
0 4
.
护
0 3
.
0 5
.
同 工 酶 工;
b
.
2
.
同工酶 1
;
3
.
同工陇 m
,
e
.
.
a
.
5 醛 缩醉 ( 1
2 700)
;
6
) 0 0
;
1
二
.
同工 酶 工 ;
2
.
同 工醉 n
)
;
;
3
.
同工酶 m
.
.
M
, 。
分子 t 标 准 品
,
牛血 清 白蛋 白 ( 6 6
200)
;
e
.
卵清 蛋 白 ( 4
X ) 磷酸 化 酶 ( 97 4 (
d
.
L
牛 血 清 白蛋 白 ( 66 2田 )
0 00 )
;
e
.
卵 清蛋 白 ( 4 2 7( X ) )
.
;
d
.
糜 蛋 白酶 原
A ( 2 4 70 0 )
e
核糖 核 酸 醉 A (
13 7 0 0 )
.
碳酸酥酶 ( 3 1
溶 菌醉 (
14 4 0 0 )
图
3
用 S Ph
a c r
yl
5 2 0 0 凝 胶过 滤 法
图 4 S D S P A G E 浏 定蔗 糖酶
同 工 酶 的 亚 基分 子 量
.
测 得 同工 酶 的 全 酶 分 子 量
F ig 3 In
2 3 3
. ,
E
t
s
t
im
a t
i
o n
o
f M l
e r
o
e e u
l
a r
W
e
ig h
t
o
f
t
h
n
e
F ig
4
P o ly
o
a e r
y
la m i d e G e l
v e r
v e r
a s e
b y S e Pha
y l
5 2 0 0 G e l F i lt r a t io
SDS P AG E
f P
u r
i f i e d In
t as e
等电 点 的 测 定
种 同 工 酶 的 在 等 点 聚 焦 电泳 中 均 呈 现 一 条 酶 蛋 白带 ( 图 5 )
.
同 工 酶 工的 等 电 点 为
p H
4 0
.
,
同工酶 n
第
期
p H 3
.
褚
8
,
波
,
等
:
接 骨 草 蔗 糖 醉 同 工 酶 的 分 离纯 化 及 其 部 分 性 质 研 究
p H 3
.
1 1 19
的 等 电 点为
2 4
.
.
同 工 酶 n 的 等 电点 为
o
5 7
、
.
米氏常数 K m 的侧定 用 5 84一 58
.
4 mm
l/ L 的蔗糖 为底物 在 5 0
.
.
30
℃ 条件 下 与 酶 作 用 3 0
m i n
K m
[ 求得蔗 j 用 双 倒数 作 图 法 8
30 m m
o
糖 酶 同工酶 I 的表观
拌g
为
l/L
57
,
V m
.
a x
为
95
,
/ m in
a x o
;
同工 酶 1 的 表 观 Km 为
4 8 产g
1
mmo l/ L
V m
为
,
/ m in 为
;
同工 酶 1 的 表 观 Km 为 /m
in ( 图 6 )
.
65
mm
2 5
.
l/ L
pH
V m
a x
3 5 拜g
对阵 反应速 度的 影晌
℃ 条 件下 测定 蔗糖 酶在 p H 3 ~
一
1
.
同工 醉 工 ;
2 .
同工酶 n
·
;
.3
;
同工 酶 1
b .
.
.
M
.
在 3 0 活性
,
7
的
。 2
.
等 电 点 标 准 蛋 白质
.
;
.a
淀 粉 葡萄 搪 糖 昔 酶 ( 3
A
;
50 )
大 豆 胰蛋 白醉 抑 制 剂 ( 4
) 8
; e
.
55 )
.
c .
日
肌
mo l / L 的 磷 酸 柠檬 酸 缓 冲 液 中 与 底 物 作 用 3 0
mi n 的 乳 球蛋 白
.
d
.
牛 碳酸酥酶 ( 5
,
人 碳酸 醉 醉
,
B
6 (
;
.
.
5
.
) 5
;
L
结果 表 明 同工 酶 I 和 同 工 酶 1 在
,
p H 4
4
~
5 0 红 蛋 白 (酸 性 带
,
.
6
.
85)
,
;
9
.
肌 红 蛋 白 ( 碱性 带
,
7 .
.
35)
;
h
扁 豆 凝集
时 有最 大 活 性 性 (图 7 )
、
同工 酶 n 在
3 0 ℃ 保温 l h
pH3
.
9~ 4 2
一
.
( 酸性 带 时有 最 大 活 素
( 碱性带
,
8
.
.
15 )
;
1
.
.
扁 豆凝 集 素 ( 中 性 带
9
.
8 45 )
j 扁 豆凝 集 素
.
将 酶 置 于不 同
,
pH
,
的 磷酸 柠 檬酸 缓 冲液 然 后 按 常规 方 法 测 定 酶
p H 3~
8 65 )
.
k
胰 蛋 白醉 原 (
) 3
.
) 中 P H 3~ 8 (
图 5
F ig 5
.
等 点 聚 焦 浏 定 蔗 糖 醉 同 工 酶等 电 点
Is
v e r
o e
活性
6
.
结 果 表 明 三 种 接 骨 草 蔗 糖 酶同 工 酶 均 在
.
le
e tr
ie P o in
t
De
t
te r
m in
a t o n i
o
f In
v e r
t as e
) 范 围 内 比较 稳 定 ( 图 8
I
, ù 乙 飞
,
In
t as e
1
a n
d In
v e r
a s e
l
兰。
目 ,灿 二 口 众 日
.
.
3
0 . 0. 1 2
划 版 之
一
刃 沁
一
O 匆
刃 6 0 印 1 田
l /5
·
!2 0
·
14 0
1 扔 18 D
1 /m m o l L
.
l
pH值
1
.
同
工酶 工
;
2
同工 醉 n
;
3
.
同工 醉 1
.
- 今~
同工 曲
1
. . 卜
.
同工 醉 1
叫` ~
同工 醉 m
p H 曲
e
图 6
F ig
2 6
.
.
L n e e a 接 骨 草 蔗 糖 酶 同 工 酶 1的 i wv
6
e卜
B盯 k
ta s
图
e
图
Fig
.
7
接 骨 草 蔗 糖酶 同工 酶 活 性 的
PH
线
e r
L in
e
w
e a v e r一
Bu
r
k P lo
t
o
f
t
he In
v e r
7
C
u r v e
o
f
t
h
e
A
e t v i
it y
o
f
th
Iv n
t as e
结 果 表 明 接 骨 草 蔗糖 酶 同工 酶 I 和 同工 酶 n 在 4 8 一5 2 ℃ 有 最 大活 性 同工 酶 m 在 5 0 ~ 5 ℃ 有 最 大 活性 ( 图 9 ) 将 酶液 在 相 同 p H 条 件 (pHS 0 ) 不 同 温 度 以 及 同 一 温 度 不 同 时 间 处 理 后 再 按 常 规方 法 测 定 酶 的 活 性 以 直 接 反 应 的 酶 活 力 为 0 0 % 其余 所 得 数 据 与 直 接 反 应 的 酶 活 力 之 比 为 百 分数 再 对 保 温 时 间 作 图 ( 图 1 1 0 ) 结 果 表 明 3 种 同工
,
. .
温 度 对 醉反 应 速 度 的 影 晌 在 p H 条 件 和 底 物 浓 度 相 同但 温 度 不 同下 测 定 蔗 糖 酶 同 工 酶 活 性
、
,
,
,
,
,
,
.
,
酶均在 在 5 0 ℃ 以 下 较 稳定
,
超过 5 0
℃ 酶 活 性 则 下 降较 快
.
加 O 幻 8 加 0 4
口 、 划 收
攀 成 迷
p H值
0 3
,` ~
35
0 4
~ .
5 4
.
0 5
~
55
`沪
.
0 6
系列 3
65
叫卜 同 工 酶
I
闷.
~
同工 酶 n
同 工醉 m
.
闷冲 .
系列
温度 /℃ 卜 系列 2
图 8
F ig 8
.
接 骨草 蔗 糖 酶 同 工 酶
PH Curv
e o
p H
o
德 定性 曲 线
v e r
图
F ig 9
.
9
蔗 糖 酶 同 工 酶 活 性 的 温度 曲 线
r Cuv
e
f t h e S t a b i li t y
f t h e In
ta s e
T e
m pea r tu e r
o
f te h
i ty o A e t iv f
t he
I n
v e
t r
e s a
西 南 师 范 大 学 学报 自然 科 学版
第
划 艇 8 8 眨
卜 卜
卷 8
版 划 缝
8
版 划 班
`
é 仁 一
h
n
时间
同工 醉
时间 儿 同 工醉
时间 几
同工 醉
图
h hw
n n
n
不 同温 度 下 蔗 箱 酶 同 工 游 活 力 随 时 间 的 变 化
h
n
F
C
p
讨
论
、
h 淀 经 过 硫 酸 钱分 级 沉
.
A
,
子交 换层 析 离h
、
凝胶 过 滤 层 析 纯 化
,
分离 出
.
3
种 蔗糖 酶同工 酶 通 过 S D S P A G E
3
E I
、
F
电泳 鉴 定
p H
、
,
表 明从 接骨 草 叶 片 中 提取 的 蔗 糖 酶 已 达 到 较 高 的 纯 度
、
.
种 同 工 酶 具 有 相 似的 分 子 量
、
、
等 电 点 最适
,
最 适 温 度 以 及 酸 碱 温 度 稳定性
,
3
种 同工 酶 在 叶 片 中 不
,
同的含量
K m
.
值
、
V m
a x
表明
在 接 骨 草 生 理过 程 中
主 要 发 挥 作用 的 可 能 是 同 工 酶 I
其 他 两种 同工 酶
,
起 辅 助 作用
通过凝 胶过滤 法
,
S D S P A G E 法 测得 了 3 种 同 工 酶 的 全 酶 分 子 量 和 亚 基 分 子 量
,
,
结 果表 明
3
,
种 同工
酶都 是 由相 同 亚 基 组 成 的 双 亚 基
酶
这 与 甘 薯 叶 片〔
.
’。
〕
、
柑桔 叶 片8 j[
、
大 豆叶 片〔
’ `
〕
中 的 蔗 糖酶 相 似
说 明在
植 物 中 蔗 糖 醉 可 能 主 要 以 双 亚 基 的 形 式存 在 对
3
种 同工 酶 的最 适
,
p H
,
酸 孩 稳定 性 测 定 表 明
.
,
接骨 草 叶 片 中 的 蔗 糖 酶 都 是 耐 酸 的 酸 性 蔗 糖 酶 此 性
,
质有 利 于 其在 医 药
工 业 中 的应 用
但是 接 骨 草 蔗 糖 酶 的 热 不 稳 定性 以 及 在 分 离 纯 化 过 程 中 的 低 回 收 率 是
.
制 约 接 骨 草 蔗 糖 酶 进 一 步开 发 利 用 的 瓶颈
因此
,
利 用 分 子 修饰
,
人 工进 化等 分 子 酶工 程方 法 改造 接 骨草
.
蔗 糖 酶 和 提高 在 分 离 纯 化 过 程 中接 骨草 蔗 糖酶 的 回 收 率 是 下 一 步研究 的 重 点
参考 文 献 :
〔l ] 〔2 〕
刘 晓雯
a n S j a
,
刘 克武
a
,
江
n a n
淡
5
:
.
,
等
Eh n
.
小 肠 蔗 糖酶 的 化 学 修 饰 及 对 酶 活 力 的影 响 〔J 〕 化 学 研究 与 应 用
a n ee
.
,
20
3 0
r
,
5 1
n
:
78 3
一 7
.
5 8
.
y
G
n d
,
,
Su gu
200 6
,
d pH
.
a n
d T h e r ma l S a t b i li t i e
s
o
f In
v e r ta s e
I
Fo
o
d Ch i
em
94
.
57 3 一 57 9
r o m n
f Su
b i li z e d
o n
Mo
n t
o m
i ll o
一 it e K 1 0
[ J〕
:
〔 」
3
T
a n r s ev e n
A
.
D o
,
G
I m m o
o
b i li :
a
t
o i
n
o
f Iv n
e r t a se
Wi t hi n
C a le i u m A lg i n
at e
G
e
l C a ps
u
le
s
[ J」
.
Pro
e
氏
o e
h
m e
,
20 0 1
,
36
1 0 8 1 一 10 8 3
[ 4〕
Am
a
y
a
D
e
ig a d o L
H i d a lg
.
L
a r a
M E
,
,
M
,
o n t es
Ho
r e a s
it a
.
s
.
M C
H yd
r o
l y s is
o
e ro se
b y In
v e r ta s e
I m m o b i liz
e
d
o n
Ny
-
lo n 6
e o b e a d s [ J〕 O Mi r F
o
d Ch e m
s a
20 05
93
:
4 26 一 43 1
[5]
M il i
o r
G L
.
.
Us
e
o
f D in it o r
t ie y
L i c A e id R
e ag e n t
In
v e r
ta s e
fo
r
De
te r
m in a t i o
n
o
f R e d u e i略 S u g a
r
.
A
n a
l C hi m
,
195 9
.
31
:
426 一 4 28
〔6 〕
B
r a
df o d r
te
.
M M
e
R a p id
n
a n
.
d
S e
A
n s
it iv
e
o M e t ho d f
h m
e
,
r
伽
,
a n t
i t a t io
n
o
f M ie
r o
g a r m
Q
u a n
t
i t ie
s
o
f Po r
t
n e i
,
U t i li z i n g
t
h e P r i n e i p le
o
f
Po r
in D y
,
B in d i g
.
〔J ]
n a
l Bi
o e
197 6
72
:
248 一 254
.
7 【 」 朱 广廉
.
杨 中汉
SD s
聚 丙 烯 酞 胺凝胶 电 泳侧 定 蛋 白质 分 子 量 〔月 植 物 生 理 学 通 讯
. .
,
19 82
3
2 ) (
:
:
3 4
一 4 .7
.
阳〕 唐 云 明 柑 叶 片蔗 糖 醉 的 分 离 纯 化及 其 部 分 性 质 的 研 究 〔J 」 植 物 生 理 学 报 〔9〕
张 龙翔
, ,
,
199 5
,
,
( 8 7 )
59 4
.
一 60
张庭 芳
,
李令媛
.
生 化 实 验 方法 和 技 术 〔M 〕 北 京
.
:
高等 教 育 出 版 社
.
9 9 1 7
.
In
,
一 11 6 1 996
,
0 」唐 云 明 1 仁
黎
南
.
,
陈定 福
.
甘薯 叶片 蔗 糖 酶 的 分 离 纯 化及 其 部 分 性 质 [ J〕 植 物 生 理 学 报
.
2
( 1) 2
:
5 4
一 5. 0
11 「 」张 振 清 夏 叔 芳
,
大豆 叶 片 蔗 糖 酶 的 分 离纯 化 及 其 性 质 〔J 〕 植物 生 理 学 报
,
9 8 1 4
,
0 1
:
6 9 一 2. 1
第
期
褚
波
,
等
:
接 骨 草 蔗 糖 酶 同 工 酶 的 分 离纯 化 及 其 部 分 性 质 研 究
112 1
I s o la t io Is
o z
n
s
,
P
o
u r
i f ic a t i o
v e r
n
a n
d So m
e
P
r o e
Pe
r
t ie
s
o
f th
e
y
me
f In
ta
s e
in S a m bu
e u s
h in
e n s
i s L in d l
C H U
S
e
Bo
ho
o
,
WU
S e C n
d fr
ip it
o
a
I
Zh
,
o n
th w
g lia
t
一
n
g
,
,
T AN G Y
n Co h
gq
jn
u n
价a
一
m in g
l
o
f L沙f e
Ce
S O
u
e s
山 V e
o
e
声
s i ty r
g 4
0
h i
n
7 15
,
C h
i
s
A bs tr
p
u r
a e
e
t
:
In
a
v e r
ta s e
o n
,
s o
lu
t
io
n
e x
a
t r a
e
e
te
o
m
th e
,
le a
v e s
一
f S a m b“
ph
a r o s e
c u 、
`
n e n s
e r o
L in d l ha
a
s
,
be
e n
is
e
o
la
ph
o
t e
d
a n
d
ifi d by
e o
mm
t io n
iu
a n
m
d
s u
lp h
t
p
y
r e e
t io n
v e r
DEA E S
ta s
r e s
e
e o
.
l m
e e
u
h
m
to
o z
g
y
r a
p
hy
a n
d S h
o
a e r
y 1 S
200 g
a s
l f ilt
w
n
r a
th r ee
a n
,
is
o z
m
e
e
f in
e
,
w is
.
e r e
o e e
b
ta
in
o
e
d
e u
T h
p
u r
ifie d is
t
.
m
e s
w
e r e
e s
m
g
e n e o u s e
s
h
一
in
SDS PA G E
e r e
d IE F
44
.
le
t
r o
p ho
.
T h
m
le
la
r
w w
ig h
o
f
th e
,
is
o z
.
y
m
d
,
e te r
m in
d by
r e
-
SD S P A (; E w
s
45
.
7 K D
e
9 KD
4 4
e
1 KD
r o
a n r e s
J ,
d g l
is w
filt r a t io n
p
e r e
.
91 2 K D
89
75
1 K D
pe
n
e
,
88
v e
.
1 KD
p
e e
t iv e
ly
.
T he P l d
y
t e r
m in e d b y I E F e le
o
t
p
o
ho
e r e o
H4 0
a n
.
,
pH 3
8
,
p H 3
e r e
.
r e s
ti
ly
.
T h
e
,
K m
35
e
o
f
t
h
e
is o z
m
p
一
e s
w iv
e
.
e r e
30 m m
l/ L
u
,
57
.
1 mm
r a n
l/ I
e
65 m m
o z e o
r a n v e r
l/ L
a n
d Vm
2
a x
w w
9 8 拼g
.
/m i
一
4 8 拌g
o
, ,
/m
in
2
产g
/ m in
pH 3
r e s
.
e e
t
ly
2
.
.
T he T h
e e
e
0 o
1) t i m
u
m
te
p H
g
o
f is
g
y
m
e
1
o
d 15 0
a n
一
卿
e
班
y
a s
p H 4 4
a s e r
一
pH S
.
a n a n
d 15 0
o z
卿
l
w w
a s
9
一
p H4
.
p t it n
o z
m
w
m pe
s
ra
tu r e
ra n
f iso zy m e l
g
e
d is
o z
mel w
d
o
u n
48
C o
.
52 o C
d is
y
me 班
a s
50 ℃
o r
55 ℃
T hr
o
is
ym
e s
c
e re
ta
ble
、
a t
the
;
f pH3 PH6
is
o z
a n
d
50 o C
a n
K ey w
ds
:
Ie
a v e s
f Sa m bu
c u s
h 乞n
e n 、
15 1 i n d l
in
ta s e ;
y r n
e ;
is
la t io
n
d p u r if ie a t io
n ;
pr
o
p
e r
t
ie
s
责任 编 辑
产、 、
例 尸~
胡
杨
、
口
产 . 、卜 护
一 、 、
钊 尸
、 ~
~
习
尹 ~
~
厂, 、 、 洲
六
、
侧
广
、
~
广、
叫产
户、
习
产
~
,
~
~
.
吮子
产、
,
尸
产、 习
尸 ~
几吮目
产、
尹
产
、
、` 护
~
、
创
~
、
洲
尸 ~
, `了
产 ,
.
产
、
曰
产 ~
、
~
产、
洲
产 、 、创
产,
,
2
尸
、 创
户、 ~
产 、、
J
尸 、 、~
户 ,
、 勺 子
尹 向
、
曰
` 产
户
%
尸 几
~
户、
子
尸肠 、
“
产、
~
产, , 、 浏
产、 创
尸城 、 吻
户
尹, 、
、
洲
产、
、 声
产, “
广、 、 创
( 上接 第 1089 页 )
Det
e r
m in
a
t io n
o
f VB
n
一
Z
,
V B`
,
V B
i Z ,
V C
s e
a n
d F o li c A c i d
by I o
P
a
ir R
,
e v e r s e
Pha
HP LC
g m i n g
,
一 ,
WA
H U AN G
S ho C
A bs tr
t io n
o
,
NG
e n
e
Li
g
a
,
ZH O U G
u a n
一
Ch
tr y a
n
WA
j
N G
,
s
h
s
a o
t
y
u n
rs
G AO
Ch
o n
Zh i
,
一
x
ln a
i
l
o
f Ch m
e
夕s
e d Ch m了
印g
了n e e r了n
g
S O
u r h
昵
山四
J
jty
,
gq
声 n
g 400 7巧
Ch
a e
t
:
A
,
n
a e e u r a
。 V B
,
t e a n
d
,
r e
li a b l e i o
a n n
n
一
p
a
ir
r e v e r s e
,
Pha
v
s e
H P LC m
s
e
t
ho d w
s e
a s
e s t a
b li s h e d f o
H ype
,
r
th e
de
te r
m in
,
a
-
: f V B
V B
I:
V C l m
io
e
.
d fo lie b
y
u s
a e
id
T h
e
e s e
i t a m in
e a n
.
be
p
e
a r a a e
t e
d
o n
r s
,
ilC 1 8 ( O D S Z
a
.
5
o
拼m
4
.
6 m m 又 1 50 m m )
s o
e o
、 l
in g
V (m
o
.
t
h
a n o s e
”
l)
,
V (0
5%
a e e
ti
id ) = 3 0
a
70
( dd 2 5 m m
o
l
e
p
s
e rl
t a n e
diu m m
w
e r e u r
ie
th
y
a n a
)
a s
一
m
b ile p h a
一
w it h U V
: / m l (B )
, ,
de
,
te e to r
a t
w
.
a v e
le n g t h
f 254
n
.
m
,
T h
2
.
t a n
一
da r d
7
e u r v e
a s
lin
e a r
,
in 2 0 又 1 0
,
?
一 8 0 火 10
6
.
g
一
2 O义 10一 “ 一 5 0 只 10一 ` g
。 /mL(B )
.
0火
10
一8
.
.
0 只 10 一 ` g
e
/
;: ml (B )
2
.
0 X 10 一
9
一 5 0 X 10
,
5
9/ m L (f
o
lie
1o
一 9
a e
id )
a n
,
d 5
.
0 X 1 0 一 ’ 一 8 0 X 1 0一
5
9
/m L
n
(VC)
T h
,
t de
。
,
e
t io c
n
12 ,
l i而 t w V C
a n
a S
6 丫 10 一
a e
9/m L
6 义 10 一 8 9 /
e
I m
a s
J ,
7x
e n
9
/mL
b
r
6 火 10 一 8 9 / m L
a
n d a
e
l 火 1 0一 9 9 / m L
te r
fo
ta
r
: V B
V B
e o
:
V B
d f o lie
a n
id
y
.
T h
o n
m m
e t a r
ho d h k
e t
,
be
s u e e e s s
f u lly
e o s
p p lie d
a n
to
th
r a
de
.
m in
a
t
io
o
f
bl
e
t
o
f
m
p le x
V it a m in d p ll a
一
d h
o n e
th e
a n e e
w hie h p r
o v e
r a
d
t o
;
im p le
;
d
r
P id
o x
Key w
o r
ds
r e v e r s e
s e
a e
h ig h P e r f o r m
id
;
liq u id
e
h
r o rn a
to g
P hy
ib
f la v i n
py
id
in
e ;
e
y
a n o e o
ba la
-
m in
a s e o r
bie
f o li e
a e
id
;
责 任编辑
潘春 燕