人鼠嵌合抗体的基因构建_胡迪超

DOI：10.13200/j.cjb.2009.09.99.hudch.008

中国生物制品学杂志2009年9月第22卷第9期ChinJBiologicalsSeptember2009，Vol.22No.9中国图书分类号Q782文献标识码A文章编号1004-5503（2009）09-0933-05

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【综述】

人鼠嵌合抗体的基因构建

胡迪超

综述

张爱华

杨晓明

审校

【摘要】为了克服鼠单克隆抗体在人体治疗中出现的问题，经典的基因工程抗体技术将人源抗体恒定区替代鼠抗体的恒大大降低了人抗鼠抗体（HAMA）反应，而且可表定区，即构建人鼠嵌合抗体。嵌合抗体不仅保留了亲本抗体的特异性和亲和力，人抗体恒定区基因的钓取、鼠抗体可变区基因与现出不同的生物学功能和半衰期。本文就嵌合抗体鼠抗体可变区基因的克隆、人抗体恒定区基因的拼接及表达载体和宿主细胞的构建作一综述。【关键词】嵌合抗体；可变区；恒定区

ConstructionofHuman／MouseChimericAntibodyGene

HUDi-chao,ZHANGAi-hua,YANGXiao-ming（WuhanInstituteofBiologicalProducts,Wuhan430060,China）

【Abstract】InordertosolvetheproblemsintreatmentofdiseasesinhumanswithmurineMcAb,human／mousechimericanti－bodyisconstructedbysubstitutionofconstantregionofantibodyfrommouseoriginwiththatofantibodyfromhumanoriginthroughclassicalgeneengineeringtechnique.Thechimericantibodymaintainsthespecificityandaffinityofparentalantibodies,whilede－creasesthehumananti-mouseantibody（HAMA）responsesignificantlyandshowsvariousbiologicalfunctionsandhalf-lifeperiods.Thegenecloningatvariableregionofantibodyfrommouseorigin,geneisolationatconstantregionofantibodyfromhumanorigin,splicingofvariableregionofantibodyfrommouseoriginandconstantregionofantibodyfromhumanoriginaswellasconstructionsofexpressionvectorandhostcellsarereviewedinthispaper.

【Keywords】Chimericantibody;Variableregion;Constantregion

抗体（Antibody，Ab）是机体免疫细胞被抗原激活后，B细胞增殖分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的一类能与相应抗原特异性结合并诱导相应生物学功能的糖蛋白。抗体不仅在生物学、基础医学和临床医学诊断领域得到广泛利用，而且在疾病的预防及治疗方面也显示出巨大的应用潜力。FDA批准的第1个用于临床治疗的抗体是OKT3，SFDA批准的第1个用于临床治疗的抗体是由武汉生物制品研究所研制的WuT3，二者作为免疫抑制剂，主要用于预防和治疗同种异体器官，如肾脏、肝脏及心脏移植后的急性排斥反应。

治疗性抗体经历了3个发展阶段。第1代为多克隆抗体，第2代为单克隆抗体，第3代为基因工程抗体。单克隆抗体因其具有高效靶向性、高特异性、高亲和力以及能诱导一系列生物学效应，而被称为“魔弹”。然而，鼠源性单克隆抗体用于临床存在着诸多问题：①易引起人抗鼠抗体反应（Humananti-mouseantibodyresponse，HAMA）；②其Fc段不能有效激活人体FcRn及补体系统的效应功能；③在人体内的半衰期短，因而降低了其疗效；④反复使用易

临床应用中理想的导致机体产生过敏反应等。因此，

单克隆抗体应该是人源的，但人-人杂交瘤技术目前

作者单位：武汉生物制品研究所（武汉430060）.

通讯作者：杨晓明，E-mail：[email protected]尚未突破，即使研制成功，也存在人-人杂交瘤体外

抗体亲和力低及产量不高等问题。目传代不稳定、

前，较好的解决办法是利用分子生物学技术和蛋白质工程技术，对异源性单克隆抗体进行改造。

基因工程抗体经历了从人鼠嵌合抗体、人源化抗体、小分子抗体、噬菌体展示抗体、核糖体展示抗体到全人源抗体的发展历程。嵌合抗体最先由美国的Morrison于1984年研制成功［1］。经过20多年的发展，嵌合抗体技术已经较为成熟。人鼠嵌合抗体有以下特点：①不仅保留了亲本鼠抗体的高特异性和

②其人源亲和力，而且使鼠源性成分减少70%左右；

Fc段能有效介导生物学效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（Antibodydependentcell-medi－atedcytotoxicity，ADCC）、补体依赖性细胞毒作用（Complementdependentcytotoxicity，CDC）等；③能

亚型、类、亚类、大小、结构域自由地选择抗体的型、

及添加糖基化位点等，以利用其不同的生物学特点

④由高效真核表达载体和人抗体恒定及理化特性；

“盒子”可以容许插入不同的区组成的嵌合抗体表达

⑤操鼠单克隆抗体的可变区，缩短操作和研制周期；

作相对简单。截至2008年，市场上批准用于治疗的

分别为abciximab（1994）、rituximab嵌合抗体有5种，

（1997）、basiliximab（1998）、infliximab（1998）和cet-uximab（2004），另外还有6种正处于临床研究中［2］。

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1.抗体的分子结构及主要特点

天然的抗体分子是由两条相同的重链和两条相⑤以同一酶切的肝DNA作对照，利用South－噬菌斑；

ernblot分析基因重组的情况，确定所获得的功能性可变区基因，并进一步进行酶切分析和亚克隆。所获得的目的基因片段不仅含有来自亲本抗体高效表达所需的启动子和增强子，而且还含有真核表达所必需的亲本抗体的信号肽序列，可以最大限度地保留亲本抗体的高特异性和高亲和力，并有利于高效表达。但是，从基因组克隆中分离重排的重链和轻链V区基因，需要建立基因组文库，不仅耗时，而且工作

而量极大，未知序列的引入亦可能影响抗体的表达。

且，基因组可变区中的内含子只有在淋巴类宿主细胞中表达才有助于提高表达量。随着分子生物学技术的飞速发展，PCR技术已被广泛应用于克隆抗体的VH和VL基因，使得目的基因的克隆变得简单而高效。

2.1.2利用RT-PCR技术扩增鼠抗体的可变区基因：抗体的可变区由骨架区（Frameworkregion，FR）和互补决定区（Complementarydeterminingregion，CDR）所组成。互补决定区因其高度易变，又被称为

HVR），而可变区的骨高变区（Hypervariableregion，

架区相对保守。因此，根据小鼠Ig重链和轻链V区基因5′端和3′端相对保守的特点，可以设计相应的

，通过RT-PCR来扩简并引物（Degeneratedprimers）增重链及轻链的相应功能区。基于简并引物扩增鼠

一抗体可变区基因的引物设计方法主要有两种［4］：

种是简并引物分别与抗体可变区基因骨架区FR1和FR4互补；另一种是重链和轻链V区5′端引物与V区的信号肽序列互补，重链V区3′端引物与IgGCH15′端及V区所有J基因3′端序列互补，轻链V区3′端引物与κ链CL5′端和轻链V区所有J基因3′端序列互补。第1种方法由于FR序列较信号肽序列保守，因而较少的简并引物即可成功扩增可变区基因，但引物的简并性及必要的酶切位点的引入可能造成抗体氨基端个别氨基酸的变异甚至缺失，从而影响抗体的亲和力。由于无信号肽序列，也不利于真核表达有功能的抗体分子。第2种方法虽然信号肽序列较易变化，但基本上不会造成FR区氨基酸的改变，而且还可以提供真核表达所需的信号肽序列。

2.1.3利用RACE-PCR技术扩增鼠抗体的可变区基因：嵌合抗体要最终实现其生物学效应功能，必须在真核表达系统中进行表达。由于不同的鼠抗体其信号肽序列不同，现有的简并引物还不能完全涵盖所有鼠抗体可变区5′端的信号肽序列。因此，使用简并引物进行鼠抗体可变区的克隆仍有15%～35%失

同的轻链通过二硫键以及离子键、氢键、疏水键和范德华力等连接在一起形成“Y”字形的四肽链分子。重链氨基端近1／4区域的氨基酸序列复杂多变，被称为重链的可变区（VH）；其余部分相对较保守，被称为重链的恒定区（CH）。轻链氨基端近1／2区域的氨基酸变化较大，被称为轻链的可变区（VL）；其余1／2区域的氨基酸较保守，即为轻链的恒定区）。按照重链恒定区划分，抗体可分为5类：IgM、（CLIgG、IgE、IgA和IgD。其中人IgG又分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG44个亚类，而鼠IgG分为IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG34个亚类。轻链又可划分为两型：κ型和λ型。小鼠体内的κ型占95%，λ型为5%；而在人

κ型占60%，λ型为40%。IgG、IgA和IgD的体内，

CH1与CH2之间存在一铰链区（Hingeregion），长度为10～60个氨基酸不等。铰链区富含脯氨酸，赋予了Fab较大的自由度，有利于抗体抗原反应；也含有数目不等的半胱氨酸，参与二硫键的形成。铰链区较

在构建人鼠为伸展，易于被蛋白酶酶解消化。因而，

嵌合抗体基因时，为发挥嵌合抗体的有效生物学功能及延长其半衰期，通常考虑构建IgG1κ型的嵌合

90%的HAMA反应是针对抗体恒抗体。研究发现，

定区的，因此将人的抗体恒定区，替代鼠单克隆抗体

的恒定区可以大大减少HAMA反应。2.

人鼠嵌合抗体的基因构建

人鼠嵌合抗体的基因构建主要包括鼠抗体可变区基因的克隆、人抗体恒定区基因的钓取、鼠抗体可变区基因及人抗体恒定区基因的拼接以及高效表达载体和宿主细胞的构建等。2.1鼠抗体可变区基因的克隆

2.1.1从杂交瘤细胞基因组文库中筛选功能性可变区基因：在构建人鼠嵌合IgG1κ抗体基因时，准确地克隆鼠抗体的可变区基因最为关键。为了从杂交瘤细胞中获取目的基因VH和VL，以往的文献报道是使用不同的限制性内切酶对杂交瘤细胞基因组DNA进行酶解，再采用Southernblot法对酶解片段进行分析，从而获得目的基因［3］。其基本流程为：①从杂交瘤细胞中提取基因组DNA，酶切消化后，电泳分离15000～20000bp区段的DNA；②离心提取λ噬菌体EMBL3的DNA，并制备双臂；③将杂

经体外包装交瘤细胞DNA与λDNA双臂过夜连接，

后，转染受体菌Q359，铺平板进行λ噬菌斑培养；④制备合适的Jκ、Vκ、JH和VH探针，杂交筛选阳性

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·935·

败［5］。Doeneckek等［6］建立了一种克隆抗体可变区基因的新方法———RACE（RapidamplificationofcD－NAends）-PCR。RACE-PCR是以PCR技术为基础，使用Oligo（dT）对mRNA进行反转录的同时，在两端加上通用linker引物，利用基因特异性引物，从部分已知的cDNA序列扩增其他未知部分的5′端和3′端［7］。要扩增带有信号肽序列的鼠抗体可变区基因，即以铰链区与恒定区交界部分为基因特异性引物，利用5′-RACE技术扩增未知的含信号肽序列的可变区。许多文献报道已成功利用RACE-PCR技术扩

9］

增出抗体可变区基因及其信号肽基因［8，。2.2人抗体恒定区基因的钓取

人抗体恒定区基因的钓取要比鼠抗体可变区基因的克隆容易得多，因为恒定区基因非常保守。在美

）、欧洲生物信息中心（E－国国立生物信息中心（NCBI

BI）、法国免疫球蛋白基因序列数据库（IMGT）等数据库中，很容易找到人抗体的恒定区基因序列以及引物。一般情况下，扩增人抗体恒定区基因应该考虑扩增其内含子区域。有研究表明，带有天然的或人工合成的内含子序列，有利于维持外源蛋白前体mR－NA的稳定性，从而提高翻译效率，增加蛋白质的表达［10］。有利于内含子剪切的共有序列由3部分组

①剪接供体（Splicingdonor，SD）：5′-C（A）A-成［11］：

GGT（A）AGT-3′，位于内含子的5′端与外显子交界②剪接受体（Splicingacceptor,SA）：5′-CAGG-3′，处；

位于内含子3′端与外显子交界处；③在内含子受体位点的上游11核苷酸处为分支点（Branchpoint）T／C。然而，带有内含子序列的恒定区基因较长，仅人的CH1区与J区间的内含子长度即达约1000bp，片段过长的抗体基因序列有增加碱基突变的风险，如果突变发生在内含子的剪接处，有可能对抗体的表达造成严重的后果，重链内含子中的未知序列亦可能降低抗体的表达。因此，对内含子序列的背景不很清楚时，应考虑克隆其cDNA序列。并且，在构建高效表达载体的过程中，由于引入了强启动子、增强子和相应的表达调控序列，使得嵌合抗体也能高水平表达。因此，通常以mRNA为模板，RT-PCR扩增抗体恒定区CH1～CH3之间的序列。在选择抗体恒定区的类别时，要有效发挥其生物学功能并延长其在

13］

人体内的半衰期［12，，通常考虑IgG1亚类κ型。2.3鼠抗体可变区基因与人抗体恒定区基因的拼接

许多嵌合抗体的表达载体在构建的过程中，即

15］

。因此，若要成已连接了人抗体的恒定区基因［14，

功克隆出鼠抗体的可变区基因，只需用连接酶将其与表达载体连接即可。如果表达载体不带有人抗体

（Genesplicingby的恒定区基因，通常利用SOE-PCR

overlapextentionPCR）技术［16］，在体外将抗体可变区基因与恒定区基因拼接。SOE-PCR是一种简单、高效而又快捷的方法，目前已广泛应用于基因工程抗体基因的构建中，如嵌合抗体、单链抗体、CDR移植抗体等。其基本步骤为［17］：①分别设计a、b、c、d4条引物：a为嵌合基因的上游引物，d为嵌合基因的下游引物，b的3′端序列部分与基因Ⅰ模板链5′端部分序列相同，其5′端序列为基因Ⅱ模板链3′端部

c同理，因此引物b与c可互补；②分别扩分序列，

增基因Ⅰ、基因Ⅱ，反应产物为A-B和C-D；③将两种纯化产物以合适的比例混合，经变性及退火处理，A-B链与C-D链因部分序列互补而形成杂交链；④在DNA聚合酶的作用下，形成嵌合基因A-D链。利用SOE-PCR技术构建基因工程抗体基因的另一个优势是定点突变［18］，可以对表达载体或抗体基因进行改造，以提高载体的表达水平及改善抗体的特异性和亲和力。在利用SOE-PCR方法进行嵌合基因的拼接时，应首选高保真的DNA聚合酶。但许多载

高保真DNA聚合酶并不具备加“A”尾体为T载体，

的能力，通常的解决办法是：①将Taq酶与高保真酶按一定比例混合后加入PCR反应体系中，如商业化

②先用高保真酶做SOE，的TaqPlusDNAPolymerse；

循环完毕将其置于冰上，补加0.7～1U的Taq聚

72℃循环8～10min；③用高保真聚合酶进行合酶，

SOE后，将纯化产物用专门的加“A”尾试剂盒进行加“A”尾；④以基因工程技术对DNA聚合酶进行改造，既具备高保真性能又兼有加“A”尾能力的DNA聚合酶目前已有产品上市。

2.4高效表达载体和宿主细胞的构建

嵌合抗体的特异性和亲和力依赖于能否准确获取可变区基因；嵌合抗体的生物学功能又取决于所选择的抗体亚类或型；而嵌合抗体的表达水平主要取决于表达载体和宿主细胞。目前，基因工程抗体已在多种表达系统中成功表达，对于嵌合抗体，哺乳动物细胞表达系统［19］是最佳的选择。哺乳动物细胞内有抗体折叠形成正确空间结构所必需的分子伴侣和折叠酶，其内质网为抗体分子正确折叠和链内及链间二硫键的形成提供了有利的氧化还原环境。此外，哺乳动物细胞表达系统还拥有完整的转录和转录后、翻译和翻译后修饰、信号肽的剪切以及糖基化等优势［20］，使表达的抗体空间结构近似于天然，有利于发挥其生物学功能，并延长其在体内的半衰期。用于抗体表达的哺乳动物细胞有淋巴细胞，如小鼠骨髓瘤系SP2／0、NS0和大鼠骨髓瘤系YB2／0，及非

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淋巴细胞，如CHO、COS、HeLa细胞等，可根据不同的实验目的和要求，选择不同的宿主细胞。CHO细胞因其遗传背景清楚，转染效率高，适用于多种载体表达，可长期稳定传代，并能表达有功能的抗体分子，可用无血清驯化培养及适应性悬浮培养，适于大规模生产。Page等［21］利用人β-actin强启动子、多聚腺苷酸加尾信号以及共扩增基因，使重组抗体在CHO细胞中的表达量达200μg／ml。近年来，在生物反应器中，哺乳动物细胞的抗体表达量已经达到

“克”级的水平。随着表达载体和细胞工程技术每升

的不断发展以及生产工艺的进一步优化，其表达量仍有提高的潜力［22］。

嵌合抗体的表达载体是获得功能性抗体高水平表达的关键。因此，在构建表达载体时，应着重考虑

①选择强启动子和增强子。目前商业化以下几方面：

的强启动子有SV40、人类巨细胞病毒（hCMV）和EF-1α，但是启动子具有组织特异性，并且不同的宿主细胞启动子的转录效率也有差异；②转录终止信号和多聚腺苷酸加尾信号。强转录终止信号和加尾

从而提高抗体的表信号可提高有效mRNA的丰度，

达水平；③启动子下游的真核内核糖体进入位点（IRES）对于所有抗体基因的表达都是必需的。真核的内核糖进入位点通常为GCCGCCA／GCCAUGG+4的共有序列；④扩增基因拷贝数的共扩增选择标

［24］

常用二氢叶酸还原酶（DHFR）志。对于CHO细胞，

［23］

［25］

和谷氨酰胺合成酶（GS）等共扩增基因来提高目

本较低等。虽然嵌合抗体仍有30%左右的鼠源性成

分，但90%的HAMA反应是针对抗体恒定区的。有证据表明，嵌合抗体能有效降低人体内的HAMA反应，目前，尚无科学数据证明其他基因工程抗体比嵌合抗体更具优势［29］。至2008年为止，治疗性抗体中主要创造产值的仍然是嵌合抗体［30］。准确获取单克隆抗体的可变区基因是维持嵌合抗体特异性和亲和力的关键；选择合适的抗体类别或型是嵌合抗体充分发挥其生物学功能的先决条件；而构建高效的表达载体和宿主细胞是嵌合抗体实现规模化生产以应用于临床的必要前提。嵌合抗体作为一种较为成熟的基因工程抗体，在分子生物学技术、细胞工程以及下游纯化等相关技术的驱动下，必将迎来一个崭新的发展阶段［31］。

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261.

的基因的拷贝数；⑤抗体表达盒的构建。将轻链、重链分别构建于不同的表达载体或串联于同一表达载

体。据报道，双顺反子载体不仅可以将轻链、重链的表达进行偶联，而且还能够提高抗体的表达水平［26］；⑥Kozak序列。多数真核mRNAs包含翻译时结合的亚单位序列。基因序列中有无Kozak序列，其表达水平的差异常常达一个数量级。脊椎动物通用的

［27］

Kozak序列为（GCC）RCCATGG（R=A／G）。3.

展望

据预测，到2010年，全球的治疗性抗体市场额将达303亿美元［28］。鼠单克隆抗体因其在体内可产生HAMA反应因而在临床应用中受到极大的限制。随着重组DNA技术和蛋白质工程技术的飞速发展，人们可以根据需要对鼠源性单克隆抗体进行改造，以使其广泛应用于临床。人鼠嵌合抗体作为最早诞生的基因工程抗体，具有其独特的优势：保留有亲本鼠抗体的高特异性和高亲和力；在体内具有较长的半衰期；能有效发挥各种生物学功能；易于操作及成

（下转第940页）

·940·

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（收稿日期：2008-11-19）