氟乙酸类毒物检验方法评述

氟乙酸类毒物检验方法评述

1. 前言

氟乙酸类药物是一类具有速效性，高毒性，会导致二次中毒，又无特效解毒剂特性的剧毒药物，常被用作农作物杀虫用药和杀鼠剂。用氟乙酸类杀虫剂杀虫时因其对植物具有内吸作用，所以在植物体内残留期长达40-50天[1]，极易造成意外中毒。而氟乙酰胺类杀鼠剂在对鼠类有巨毒作用的同时，由于鼠类的活动区域往往处在人类的生产和生活环境中，在投放毒饵的地方人们很容易接触到杀鼠剂，也常造成各种意外中毒事件发生。虽然国家早已明令禁止生产、销售和使用此类剧毒药物，但现时，此类药物仍屡禁不止，因误食、投毒造成的人、畜中毒及伤亡事件时有发生。这些药物进生物体内后迅速代谢为氟乙酸[2]，与三磷酸腺普和辅酶A 作用，形成氟乙酸辅酶A ，再与柠檬酸作用，形成氟柠檬酸，抑制乌头酸酶，使三竣酸循环受阻，损害神经系统，导致出现一系列的病理改变[3]。所以, 对氟乙酸的检验是确定案件性质, 查明案件事实, 抢救中毒人员的重要依据。

2. 氟乙酸类剧毒药物概述

氟乙酸类剧毒药物是一类人工合成的剧毒化合物，常见主要有氟乙酸钠、氟乙酰胺和氟乙酸三种。其毒性、中毒症状与毒鼠强相当，且易引起二次中毒[4]，氟乙酸钠和氟乙酸在水溶液、生物体内主要以氟乙酸根离子(FA) 形式存在，氟乙酰胺在中性、碱性溶液和生物体内均会水解转化为FA( 或氟乙酸) ，因此FA 的检验对氟乙酸类杀鼠剂分析具有重要意义

氟乙酸类杀鼠剂分析方法除化学显色法、薄层色谱(TLC)等传统方法外，气相色谱(GC)、液相色谱（LC ）、气相色谱-质谱联用（GC/MS）、液相色谱-质谱联用（LC/MS）、离子色谱、核磁共振法、毛细管电泳法等方法也都有使用。

3. 检材的采取和前处理

氟乙酰胺中毒者，检材中一般同时存在氟乙酰胺和氟乙酸，也可能只含氟乙酸，单独检验氟乙酰胺时，在分离提取时应注意其发生水解。氟乙酸钠中毒，检材中以氟乙酸或氟乙酸钠存在。

在氟乙酸类中毒案件中，通常呕吐物、现场可疑物、毒饵等体外检材中毒含量高，可检出原体，而血、内脏组织等体内检材中毒含量较低，往往仅能检测出其代谢物。

液-液萃取法

氟乙酰胺和氟乙酸钠均为强极性、水溶性物质，检材只能用水、亲水性的极性有机溶剂或二者混合物浸提。体外检材可直接用甲醇、丙醇、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂浸提。血、内脏组织等体外检材一般采用不同比例的水与极性有机溶剂配制成混合剂进行提取、净化。检材用量视具体案情及检测方法而定。提取手段可采用大量溶剂浸泡过夜，也可用少量溶剂涡旋或超声提取。

提取方法一般为取适量检材加甲醇-水，丙酮-水或乙腈-水（8：2或7:3）混合溶剂，经涡旋浸提后离心，吸取上清液，用10%氢氧化钠或氨水调制PH8，90℃水浴中用空气或氮气吹去有机溶剂，剩余水溶液可直接用化学法检验，也可用盐酸调制PH2后再用乙酸乙酯提取氟乙酸，离心分离出乙酸乙酯层并加氨碱性丙酮液混匀挥干后用于检测。如果检材蛋白质含量过高，则需在前处理中沉淀蛋白。

固相萃取法

对血、尿等液体检材也可采用固相萃取法处理。固相柱可选取硅胶、C18柱。方法为将血、尿等检材用氨水调制PH8，加入蛋白沉淀剂如硫酸锌沉淀蛋白，离心取上清液，用甲醇、去离子水和PH8缓冲液活化好的C18柱过滤，控制流速1ml/min，检液全部流过后，再用5ml PH8缓冲液冲洗固相柱，然后真空抽干，用5ml 甲醇洗脱，收集洗脱液，于60℃水浴浓缩、定容后检测。若用硅胶柱，检材中加入甲醇-乙腈（1：1或3：13）混合溶剂，混匀、离心，上清液用乙醇活化过的硅胶柱过滤，收集流出液体于60℃水浴浓缩。

4. 检测方法

4.1 化学显色反应

硫靛反应：此反应的原理为含氟乙酰基的化合物在强碱性条件下与硫代水杨酸钠作用，再经铁氰化钾氧化，生成红色的硫靛化合物，检出限为10μg。

硫靛反应化学法[5]是分析氟乙酸类鼠药最为普遍的化学方法，因为其操作简单反应条件容易掌握，对体外检材和新鲜生物检材效果最佳，且根据最终反应产物硫靛的颜色就可以进行定性，但是由于大多数卤代乙酰基的化合物也有相同的反应，干扰了检验结果，容易产生假阳性，定性结果有不确定性，而且方法的检出限不高。

4.2色谱法

4.2.1 薄层色谱法 金良正[11]研究了用薄层色谱法快速鉴定氟乙酰胺的方法，采用萘氏试剂作为显色剂，氟乙酰胺显黄至红褐色，展开剂采用乙酸乙酯：丙酮=60：40，Rf 值为0.58，最低检出限10μg因此薄层色谱灵敏度不高，只适合常量分析。

4.2.2 气相色谱

GC/FID法 氢火焰离子检测器（FID ）是通用性检测器，一般含CH 的有机物都能进行检测。基于这个原理，张成福等[7]用三氯乙酸对含氟乙酰胺的生物检材进行沉淀蛋白高速离心后，直接采用大孔径毛细管柱后进行FID 检测，检测限小于0.03μg。FID 检测器是目前气相色谱仪中唯一能进水样的检测器，而且对一般有机物都能出峰，但检测的专属性不强，所以对氟乙酰胺的响应值较低，而且对内源性杂质的干扰性也较大，不太适合做氟乙酰胺的微量分析。

GC/NPD 衍生化法 关福玉等[8]对氟乙酸钠在水相中进行了直接衍生化并作了GC/NPD的测定。其原理是采用氟乙酸钠在酸性环境中以N,N-二乙基对苯二胺硫酸盐（DEPA ）为催化剂与芳香胺进行衍生化反应后，用乙酸乙酯作萃取剂进行提取检测。该方法最低检出限为0.2μg/ml ，由于衍生化产物为酰胺类物质所以该方法对氟乙酰胺没有反应，这可以用鉴别氟乙酰胺与氟乙酸钠。

GC/ECD衍生化法 于忠山等[9]通过五氟卞基溴（PFBBr ）对氟乙酸或氟乙酸钠进行衍生化后，生成氟衍生产物乙酸五氟卞基酯（FAC-PFB 酯），因该物质可以被气化且含电负性物质从而被GC/ECD检测。大量的实验表明用PFBBr 衍生化其灵敏度最高，血液中最小检测限可达1.0ng/ml，但同时也易产生较大的柱流失，而且由于生物体内的有机酸也易于PFBBr 产生衍生化作用，所以在色谱分离中会出现大量的杂质峰，影响检测器和色谱柱的寿命。

4.2.3 液相色谱

HPLC-UV 紫外检测器 因为氟乙酸钠本身对紫外没有吸收，所以需通过转变成含有紫外基团的衍生物才能进行检测。谢珍茗等[10]利用α‐溴苯乙酮作为衍生化试剂在相转移催化剂四正丁基溴化铵的催化下，将氟乙酸钠合成了α‐氟乙酸苯乙酮酯（AP-FA ），用HPLC 紫外检测器测得α‐氟乙酸苯乙酮酯的最小检测限为6×10-6mol/L。虽然α‐溴苯乙酮是种性质活泼的羧酸衍生化试剂，与

体内的其它饱和脂肪酸也能发生衍生化反应，但通过液相色谱的分离和对紫外检测器响应值的不同，对α‐氟乙酸苯乙酮酯的检测并没有造成多大的影响。

HPLC-FLD 荧光检测器 可利用具有较强荧光活性的4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（BrMMC ）[11]对氟乙酸钠进行柱前荧光衍生化反应后进行液相色谱分析该反应用四正丁基溴化铵作为催化剂，在水浴中避光反应，将FA 生成衍生产物氟乙酸-香豆素（FA-MMC ），HPLC 荧光检测器侧得其最小检测限为5×10-10mol/ml。因为紫外检测器在高灵敏度和高选择性上都不如荧光检测器，所以选择液相色谱荧光检测器可达到更好的分析效果。

4.2.4 离子色谱法

由于氟乙酸钠和氟乙酸都是水溶性的小分子量物质，所以可以选择使用阴离子分析柱结合电导型检测器进行离子色谱分离检测，与气相方法相比，该方法省去了衍生化步骤，对生物检材经过蛋白沉淀过滤后可进行离子色谱检验。王燕军等[12]利用离子色谱对生物检材中氟乙酰胺（氟乙酸钠）进行了定性检验分析，并应用该方法对死亡3年的腐败尸体的开棺检验中检测出了氟乙酸根，说明该方法适合于实际案件的检测，并测得方法的检测限为0.01mg/ml。但在实际检材的处理中，由于检材中的许多内源性杂质包括小分子的有机酸和脂肪酸等对离子色谱柱和检测器的产生较大的污染，而该方法的处理样品为水溶液而且不宜引入阴离子容易对检测结果产生干扰，因此在进行离子色谱检测前，应将样品过0.45μm的过滤膜，甚至使用超滤杯对大分子量的蛋白质、油脂等进行截留，实验结束后应用高浓度的淋洗液进行冲洗。

4.3 色谱-质谱联用法

4.3.1 GC/MS气相色谱质谱联用

张春水等[13]对氟乙酸钠、氟乙酸经PFBBr 衍生化后生成的乙酸五氟卞基酯后的质谱行为进行了报道。经检测FAC-PFB 酯的分子量为258，分子结构稳定，在GC/MS图上可明显见到分子离子峰m/z 258，经70ev 电子流的轰击，分子离子极易在O-C 键处断裂形成m/z 181的基峰。所以这两个碎片离子峰也成了FAC-PFB 酯的特征离子。对于氟乙酰胺的质谱检测，可以通过水解成氟乙酸经同样衍生化步骤后进行质谱分析或直接进行氟乙酸负离子的飞行时间质谱检测，该方法还可以鉴别出氟乙酸盐和氟乙酰胺，因为经实验表明氟乙酸盐在碱性条件

下不发生变化，而氟乙酰胺在10%氨水中加热会部分水解成氟乙酸负离子，所以可采用本底对照的方式检测出氟乙酰胺，方法检出限低于10μg/g。

4.3.2 LC/MS 液相色谱质谱联用

氟乙酸（钠）和氟乙酰胺直接进行电喷雾离子化（ESI ）效率较低，因其热稳定性较好，所以可采用大气压化学电离（APCI ）作为其离子化方式[14]，经检测表明氟乙酰胺采用SMR(+)检测出母离子为78，子离子为61，检测限为10ng/ml；氟乙酸（钠）采用SMR(-)检测出母离子为77，检测限为1ng/ml。因为液相质谱较常用的离子化方式为ESI ，考虑到氟乙酸的电喷雾离子化效率较低，所以可结合已经使用的衍生化方式进行柱前衍生化再进行液质检测。

4.4核磁共振法

用一定频率的电磁波对样品进行照射，可使特定化学结构环境中的原子核实现共振跃迁，共振时产生的信号位置反映了样品分子的局部结构（例如官能团，分子构象等）。缪振春等人[15]通过实验得出氟乙酸中的F 化学位移受PH 值的影响较大，实验中将氟乙酸转化成氟乙酸钠后可有效改善其化学位移，并且在样品中添加三氯化铬可使T1的弛豫时间缩短，在单位时间内相干累加谱图的灵敏度提高了近3倍，最低检出限可达1μg。

4.5毛细管电泳法

高频电导检测器[16]是毛细管多种检测模式中较为通用的一种电化学检测器，它采用溶液隔离的非接触模式，有效地消除了电泳分离高压对检测的干扰，同时解决了电化学检测时电极容易中毒的问题。潘爱华等[17]对水样中的氟乙酸钠直接用水萃取后，不经衍生化在优化好的电泳分离检测条件下检测出了氟乙酸阴离子，检出限为3μg/ml，而在此条件下氟乙酰胺不出峰，即不能检出氟乙酰胺，因此此方法也可以用来鉴别氟乙酸钠和氟乙酰胺。

结论

综上所述利用五氟卞基溴柱前衍生化进行GC/ECD检测是目前为止检测氟乙酸、氟乙酰胺、氟乙酸钠灵敏度最高的方法，检测限可达1.0ng/ml，也是迄今应用最为广泛的方法之一，但是由于生物检材中内源性杂质较多，且许多体内的有机酸也易与PFBBr 进行反应从而使单一用气相的保留时间定性有一定的困难。采用GC/MS或LC/MS联用对生物体内的微量的氟乙酸类物质检测可以减少假阳性的产生，对检验结果起到了确证。应用离子色谱或毛细管电泳方法检测虽然省去了衍生化步骤，但对于生物检测的处理方面不如气相多，因而对色谱柱和检测器的污染也就更为严重，而且对于微量组分的检测效果也不如气相。

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