光纤非线性光学显微成像

中国科学 G辑: 物理学 力学 天文学 《中国科学》杂志社 2007年 第37卷 增刊: 138~145

SCIENCE IN CHINA PRESS http://www.scichina.com

光纤非线性光学显微成像

付 玲①②* M. Gu①②

(① 华中科技大学武汉光电国家实验室(等), 武汉 430074; ② Centre for Micro-Photonics, Faculty of En-gineering and Industrial Sciences, Swinburne University of Technology, Hawthorn, Victoria 3122, Australia)

摘要 在光学显微成像领域, 基于光纤的小型非线性光学显微镜和内窥镜作为

传统显微镜和其他光学成像方法的一种重要补充形式, 近几年来受到人们的关

注. 该文介绍和总结了光纤非线性光学显微成像技术及其在生物医学中的应用.

首先介绍了结合非线性光学显微技术和单模光纤耦合器获得小型非线性光学显

微镜的方法; 特别对基于双包层光子晶体光纤和微电机系统扫描镜的光纤非线性

内窥成像系统进行了分析; 最后通过消化器官的组织成像实验说明了光纤非线性

光学显微镜的重要应用. 研究证明了基于光纤和微电机系统MEMS扫描镜的非

线性内窥镜的新概念, 并用于生物组织的成像.

关键词 非线性光学显微成像 光纤耦合器 双包层光子晶体光纤 微电机系

统扫描镜 组织成像

显微镜改变了人类认识世界的方法, 是人类历史上最重要的发明之一. 经过300多年的发展, 光学显微成像已成为自然科学研究领域中的重要分支, 为生命和信息等科学领域不断提供新方法和新概念[1]. 特别是上世纪末期出现的非线性光学显微镜具有光学层析能力并能在

厚组织(毫米量级)内实现高空间分辨率(亚微米)成像, 是现代光学显微成像技术的革新, 为人们研究厚组织中的分子和细胞功能提供了有力的工具. 非线性光学成像技术主要基于多光

子吸收(multiphoton absorption)[4]、高次谐波(higher harmonic)[5]和相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS)等光学非线性效应, 其中以双光子荧光成像的应用最为广泛. 自非线性光学显微镜诞生以来[4], 科学家们一直致力于将其用于活体(in vivo)成像. 然而, 复杂的光学系统和沉重的光学器件使非线性光学显微成像的研究局限于庞大的显微镜系统, 无法应用到活体的内部器官(internal organs)和整体动物(intact animals)成像.

近年来, 随着新型光纤和微制造技术的迅猛发展, 光纤非线性显微镜和内窥镜(fiber-optic nonlinear optical microscopy/endoscopy)的研究正在扭转这一局面. 光纤非线性显微镜和内窥镜是小型的非线性光学显微成像系统, 由光纤传输激发光或者非线性光信号, 并利用微型扫收稿日期: 2007-05-20; 接受日期: 2007-09-03

Australia Research Council和国家自然科学基金(批准号: 60410131, 90508003)资助项目

* E-mail:

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描机制构建光学图像. 光纤的超小尺寸(一般只有数百个微米的直径)与良好的机械和光学性能增加了成像系统的灵活性并减小了系统的尺寸, 使非线性光学成像技术在内部器官和活体动物中的研究成为可能. 自Denk研究小组和Gu研究小组先后研制出基于单模光纤的双光子荧光显微镜之后, 光纤非线性显微镜和内窥镜的研究在短短6年之内进展迅速. 光纤非线性显微镜和内窥镜研究中的关键问题是: (ⅰ) 近红外波段超短脉冲激光的传输和非线性光信号的收集. 光纤的色散和自相位调制等非线性效应会导致脉冲宽度和光谱的展宽, 降低激发效率; 光纤的低数值孔径和小芯径限制了可见光信号的高效收集、系统的信噪比和成像深度. (ⅱ) 扫描机制. 扫描器件应该具有毫米量级的尺寸, 并能实现快速扫描和高图像分辨率来实时监测生物过程. (ⅲ) 系统设计. 系统设计是非线性内窥镜研究的关键, 直接决定了系统的灵活性, 功能和应用范围. 该文研究了基于单模光纤耦合器(single-mode fibre coupler)和双包层光子晶体光纤(double-clad photonic crystal fibre, DCPCF)的非线性光学显微成像系统, 首次实现了基于光纤耦合器的双光子荧光和二次谐波显微成像技术, 并证明了基于DCPCF和微电机系统(microelectromechanical system, MEMS)扫描镜的非线性内窥镜的新概念, 使光纤成像系统的信噪比提高了两阶.

1 基于单模光纤耦合器的非线性光学显微镜

Bird和Gu首次将单模光纤耦合器引入双光子荧光显微成像, 证明了三端口的单模光纤耦合器能传输近红外波段的超短脉冲激发光并收集荧光. 与基于单模光纤的非线性光学显微镜相比[9], 使用单模光纤耦合器能将非线性显微镜的纵向分辨率提高30%, 且使系统更紧凑并具有自准直的特性. 然而, 二次谐波比双光子荧光更远离单模光纤耦合器的工作波长; 二次谐波源于相干过程, 其偏振各向异性的测量(polarisation anisotropy measurement)要求光纤耦合器能同时传输偏振的激发光和谐波信号. 因此, 我们首先研究了单模光纤耦合器在不同波长的传输特性, 结果如图1(a). 实验中端口3单模光纤耦合器(Newport, F-CPL-S12785)的工作波长为780 nm, 分束比(Splitting ratio)是50:50, 纤芯与包层的直径分别为5和125 μm. 当波长范围在770~870 nm时, 耦合器中端口3~1的耦合效率为20%~41%; 端口2~1在435~532 nm波长范围内的耦合效率为29%~41%. 当长度为2 m的光纤耦合器传输80~150 mW的激发光至样品端时, 尽管光纤中的群速度色散和自相位调制使脉冲展宽到数皮秒, 系统仍有足够的激发光功率用于非线性成像. 实验结果还表明, 单模光纤耦合器在可见光波段的功能类似于普通光学显微镜中的二向色镜(Dichroic mirror). 当435 nm的激光耦合入端口1, 端口2和端口3的分束比为99.6:0.4, 而且两个端口的输出模式分别表现出单模和多模的特征(图1(b), (c)). 532 nm的激光在单模光纤耦合器中传播时, 测量得到的分束比和输出模式也具有相同特征(图1(d)). 因此, 为了优化在基于单模光纤耦合器的非线性显微镜系统中激发光与非线性信号的传输, 超短脉冲激光通过端口3(激发臂)传递到端口1(样品臂), 后向散射的双光子荧光和二次谐波则由端口1通过端口2(信号臂)被探测器收集(图1). 光纤纤芯能消除焦点以外的杂散光, 在成像系统中具有共聚焦针孔(Pinhole)的功能.

除了单模光纤耦合器传输特性的研究, 二次谐波光谱的研究也是验证光纤成像系统的关键. 在图1的实验系统中, 我们以AF-50为样品, 用光谱仪(Acton Research Corporation)测量了经过单模光纤耦合器的双光子荧光和二次谐波的光谱. 当激发波长是800 nm时, 通过单模光纤耦合器的辐射谱包含400 nm的二次谐波谱线和430~600 nm的双光子荧光(图2). 二次谐波

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的光谱宽度约为9 nm,

约为激发光带宽的. 当激发光在780~870 nm范围内调谐时, 二次谐波光谱的中心波长则随激发光波长改变, 始终展示出倍频的特性.

图1 基于单模光纤耦合器的双光子荧光和二次谐波成像系统

(a) 单模光纤耦合器在可见光和近红外波段的耦合效率. (b)~(d) 可见光在激发臂和信号臂的输出模式; O1和O2为 0.25 NA

10×显微物镜, O3为0.85 NA 40×显微物镜

双光子荧光和二次谐波显微镜中的光学层析能力源于信号光强度与激发光强度的非线性关系, 纵向分辨率是非线性显微成像系统的重要参数. 通过在纵向位置扫描薄层AF-50, 我们得到了基于单模光纤耦合器的显微镜系统对双光子荧光和二次谐波的响应曲线(图2中的插图). 此结果表明, 在激发波长为800 nm时, 光纤显微镜对二次谐波和双光子荧光成像的纵向分辨率分别为1.8和2.1 μm. 可见二次谐波较短的信号波长使其成像的纵向分辨率比双光子荧光成像的纵向分辨率提高了14%. 当激发光波长由800 nm调谐到860 nm时, 二次谐波成像的纵向分辨率增加到1.9 μm. 通过三维相干传递函数的理论计算, 我们发现与光纤参数和光学系统参数相关的归一化光纤尺寸对基于单模光纤的二次谐波成像系统的纵向分辨率起决定性的作用, 光纤中二次谐波波长的增加使归一化光纤尺寸增大, 纵向分辨率降低[21].

图2 基于单模光纤耦合器的非线性显微镜的双光子荧光(TPEF)和二次谐波(SHG)光谱与纵向响应曲线

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用偏振的二次谐波信号来反应结构蛋白的形态是二次谐波显微镜的特性之一. 为了证明基于单模光纤耦合器的成像系统具有探测二次谐波偏振各向异性的能力, 我们研究了单模光纤耦合器对偏振光传输和成像的影响. 测量结果表明, 在整个近红外和可见光波段, 单模光纤耦合器中的材料双折射特性使其能传播特定偏振方向的线性偏振光. 因此单模光纤耦合器能传递线性偏振的激发光与高度有序的蛋白纤维(例如鱼鳞, black tetra fish scale)相互作用, 二次谐波经过光纤耦合器后的偏振状态可通过转动探测器前的偏振片并测量收集到的二次谐波强度来确定. 图3(a)和(b)是在探测器前偏振片(Newport, 10GT04)转角正交情况下光纤系统收集到的鱼鳞的二次谐波图像, 激发波长为800 nm, 探测器前的滤光片为400/9 nm. 当偏振片转角改变时, 收集到的二次谐波强度与转角θ 满足cos2θ 的关系(图3(c)). 此结果证明, 基于单模光纤耦合器的显微镜系统能保持二次谐波信号的线性偏振态, 并对结构蛋白成像.

图3 二次谐波偏振各向异性的测量

(a)和(b)偏振方向正交的二次谐波成像, 箭头方向为探测器前偏振片的转角方向. 标尺为20 μm. (c) 二次谐波的强度与

探测器前偏振片转角的cos2θ 关系

2 基于双包层光子晶体光纤的非线性光学内窥镜

由于单模光纤能传输高质量的激光束并改善成像系统的层析能力, 因而在光纤成像系统中被普遍采用. 但是单模光纤的低数值孔径(约0.1~0.2)和较小的纤芯尺寸极大地限制了对生物样品中微弱光信号的收集和探测, 使非线性光学显微镜系统的灵敏度较低. 作为光纤领域的革新产物, 光子晶体光纤能通过设计光纤中二维光子晶体的结构实现普通光纤不能具备的功能, 彻底地改变了光纤传输光束的方式. 我们首次改造了有源的DCPCF, 并将其用于光学显微成像来提高系统的灵敏度. 由于MEMS器件具有小尺寸、低功耗、利于建造“芯片显微镜”等优点, 显微内窥成像系统中的扫描机制则由MEMS扫描镜来实现. 基于DCPCF和MEMS扫描镜的非线性内窥成像系统如图4. 飞秒脉冲光经过光栅对(Newport, 1200 grooves/mm)和一个显微物镜(Melles Griot, 4×/0.12NA)后被耦合到DCPCF. 光纤中出射的光经过MEMS扫描镜后被渐变折射率(Gradient index, GRIN)透镜聚焦到样品上. 非线性光信号则通过MEMS扫描镜后被DCPCF收集到探测器.

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图4 基于DCPCF和MEMS扫描镜的非线性光学内窥镜系统

右上角是双包层光子晶体光纤的扫描电子显微镜图像与800 nm激发光输出模式的叠加, 右下角是能

实现两维扫描的MEMS扫描镜

非线性光学内窥成像系统中的DCPCF是由用于光纤激光器的有源DCPCF演化而来. 我们除去了有源光纤纤芯中的掺杂元素, 其目的是使近红外波段的激发光能在纤芯进行单模传输, 而位于可见光波段的非线性光信号则能被具有高数值孔径的内包层收集[16]. 成像系统中DCPCF(Crystal Fiber A/S)的纤芯和内包层直径分别为20和165 μm(图4). 纤芯被孔间距比(Hole to hole pitch ratio)为0.26的空气小孔包围. DCPCF的内包层和外包层则被由一圈空气小孔分开, 使内包层拥有高数值孔径(~ 0.6). 需要指出的是, 这种大面积和高数值孔径的光纤只能利用光子晶体的结构实现, 而非普通光纤的制造技术. 通过对DCPCF光传输特性的研究, 我们发现如果选择与纤芯数值孔径接近的耦合物镜, 改造过后的DCPCF在410~870 nm的耦合效率可达到80%~90%(图5). 而使用高数值孔径(0.65)的耦合物镜则会导致光泄露到内包层, 使耦合效率降低20%. 因此, 低数值孔径的耦合物镜能使近红外光耦合到纤芯中的效率为28%, 可见光耦合到内包层的效率为90%, 此数值是单模光纤对可见光耦合效率的两倍.

GRIN透镜是一种利用特定折射率分布使光线聚焦的小型透镜. 当光纤和GRIN透镜结合用于非线性光学成像系统, GRIN透镜的有效数值孔径依赖于光纤和GRIN透镜之间的距离, 因而

直接影响到光纤成像系统的效果. 例如,

光束的耦合效率与有效数值孔径有关; 成像

的分辨率与有效数值孔径的平方成正比; 双

光子荧光的强度与有效数值孔径的4次方成

正比. 因此, 研究光纤系统的纵向分辨率和

信号水平随光纤和GRIN透镜距离的变化是

优化系统设计的重要途径. 实验采用了直径

为0.5 mm, 节距(pitch)为0.2, 数值孔径为

0.5的GRIN透镜(GRINTECH)和AF-50为样

品. 实验结果表明, 当DCPCF与GRIN透镜

之间的距离增大时, 双光子荧光成像的纵向

图5 双包层光子晶体光纤在可见至近红外波段的耦分辨率逐渐得到改善, 而且探测到的荧光强

合效率

度逐渐增大(图6(a)).

如果光纤与透镜之间

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的距离为5 mm, 激发光束充满GRIN透镜的后孔径, 系统能得到最佳的纵向分辨率, 即双光子荧光和二次谐波的纵向分辨率分别为6和5.4 μm (图6(b)). 与基于单模光纤耦合器和GRIN透镜的非线性显微镜系统相比, 由于DCPCF具有高数值孔径和大截面面积, 使用DCPCF取代单模光纤能实现纵向分辨率和非线性光信号的同时最优化, 而使用单模光纤的成像系统在探测到的荧光信号最强时却不具备最高的纵向分辨率[17,23].

图6

(a) 双光子荧光强度和纵向分辨率随GRIN透镜和光纤间距的变化, 荧光强度和纵向分辨率能在间距较大时被同时优化;

(b) 双光子荧光与二次谐波的纵向响应曲线

MEMS扫描镜是成像系统中实现二维光束扫描的器件. 我们使用的MEMS扫描镜是基于电热驱动(Electrothermal actuation)的原理, 在驱动电压少于12 V的情况下其光学扫描角度可达到30°[24]. 镜面的尺寸为0.5 mm, 表面铝膜对800 nm激发光的发射率约为80%(图4). 通过在MEMS扫描镜的快、慢轴应用特殊设计的波形和2.5~7.5 V的电压, 激光束的反射角被改变从而实现二维的线扫描(raster scanning), 其扫描速率为7线/s. 图7(a)是由基于DCPCF、MEMS扫描镜、和GRIN透镜的显微镜系统获得的荧光微球的双光子荧光图像. 此结果证明了MEMS扫描镜不仅能传递近红外超短脉冲用于非线性效应的激发, 而且能收集位于可见波段的荧光信号; 飞秒脉冲经过MEMS镜面之后, 脉冲大约展宽了25%, 故可通过镀膜技术来改善这一现象. 更重要的是, 以MEMS扫描镜作为扫描机制的非线性光学成像系统所产生的图像与通过普通扫描台获得的图像高度一致(图7(b)).

图7 基于DCPCF, MEMS扫描镜、GRIN透镜(a)和基于单模光纤耦合器、扫描台、GRIN透镜

(b)的显微镜系统对微球的双光子荧光成像

标尺为10 μm

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DCPCF的独特光学性质使非线性显微镜成像系统的灵敏度得到极大改善. 通过比较由DCPCF和单模光纤耦合器得到的双光子荧光图像(图7(a)和(b)), 我们发现DCPCF的应用使成像系统的信号水平提高了两个量级. 如果使用光栅对补偿脉冲光在DCPCF中经历的群速度色散, 成像系统的信号水平将会在此基础上再提高一个量级. 成像系统灵敏度的改善主要是因为DCPCF比单模光纤具有更高的数值孔径和更大截面面积, 减少了飞秒脉冲在光纤中传输的自相位调制效应, 使飞秒脉冲具有最小的畸变, 而且对GRIN透镜的色差有更强的兼容性. 3 基于光纤非线性光学显微镜的组织成像

利用基于DCPCF, MEMS扫描镜和GRIN透镜的非线性光学内窥镜系统(图4), 我们对大鼠的大肠和胃部组织进行了成像, 结果如图8. 为了增加荧光成像的对比度, 大肠和胃部组织从大鼠(Sprague-Dawley)中剥离后, 用浓度为1%的Acridine Orange(Sigma)对其内表面上皮组织染色, 成像实验在大鼠牺牲后两小时之内完成. 大肠组织双光子荧光成像的穿透深度约为100 μm, 图8(a)是双光子荧光成像的截面之一. 光纤显微镜系统能清晰地显示表面上皮细胞和肠道孔穴(intestinal crypts, 箭头)的形态信息. 从大鼠胃部组织获取的双光子荧光图像(图8(b))展示出与大肠截然不同的形态结构, 显微系统的分辨率亦能将胃部的坑穴(gastric pits, 箭头)从上皮细胞中区分出来.

图8 使用基于DCPCF, MEMS扫描镜和GRIN透镜的光纤内窥镜系统对大鼠大肠组织(a)和

大鼠胃部组织(b)的双光子荧光成像

标尺为20 μm

4 总结和展望

本文介绍和总结了基于单模光纤耦合器和DCPCF的非线性显微镜系统及其生物医学应用. 单模光纤耦合器能传递近红外波段的激发光和收集可见光波段的双光子荧光和二次谐波, 并在非线性显微镜系统中展示出二向色镜的特性. 基于单模光纤耦合器的成像系统能保持激发光和二次谐波的线性偏振态并用于研究结构蛋白的形态. 通过引入新型的DCPCF, 光纤非线性光学显微镜的灵敏度得到极大改善. MEMS扫描镜和GRIN透镜的结合使基于DCPCF的成像系统更加小型化, 大鼠大肠和胃部的组织成像也证明了非线性光学内窥镜系统的可行性. 在将来的研究中, DCPCF耦合器[25]与内窥镜系统将会实现整个成像系统的全光纤化, 这对光纤非线性光学显微镜的发展有着重要意义. 另外, 此光纤成像技术也可与显微成像领域中新的扫描技术[26,27]结合, 拓展多光子荧光成像的应用. 随着光纤器件和微制造技术的不断发展, 光纤非线性光学显微镜系统将日趋小型化, 为传统的光学显微成像技术提供重要的补充并在生物医学领域发挥作用.

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