05分子生物学试题

华中农业大学研究生课程考试试卷

考试科目名称：分子生物学 考试时间：2005.1.26

姓名：邹晓冬(基准实验室，HZAU) 学号：[1**********]

备注：所有答案均要写在答题纸上，否则，一律无效。 一、解释名词（30分）：

hnRNA： heterogeneous nuclear RNA系heterogeneous nuclear之缩写。即核内不均一RNA，它为存在于真核生物细胞核中的不稳定、大小不均的一组高分子RNA之总称。 Alu家族(Alu Family): 是散在分布于哺乳动物基因组中的、含量最大的中等重复序列。由于序列中含有限制性内切酶Alu I的切点(AG↓CT)而被命名。有种族特异性，但同源性很高。 转录因子(transcriptional factor): 是指能够结合在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，这些蛋白质能调控其基因的转录。 SD序列(Shine-Dalgarno sequence):是mRNA中5＇端富含嘌呤的短核苷酸序列，一般位于mRNA的起始密码AUG的上游5～10个碱基处，并且同16S rRNA 3＇端的序列互补。

复制型转座(Replicative transposon):指复制型转座子的移动，其机制是首先转座子被复制，一个拷贝仍然保留在原来的位置上，而另一个则插入到新的部位，这样转座过程伴随着转座子拷贝数的增加。 核酶(ribozyme): 主要指一类具有催化功能的RNA，亦称RNA催化剂。

信号肽 (Signal peptide):常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移（定位）的N-末端的氨

基酸序列（有时不一定在N端），至少含有一个带正电荷的氨基酸，中部有一高度疏水区以通过细胞膜。 诱导(Induce): 指通过小分子诱导物参与, 使阻抑物失活或活化激活剂来实现对基因或操纵子表达的调控。

操纵元(Operon): 即基因表达操纵的单元之意。 它是一组关键的核苷酸序列，包括了一个操纵基因，一个普通的启动子，及一个或以上的结构基因被用作生产信使RNA（mRNA）的基元。

增强子(Enhancer): 是DNA上一小段可与蛋白质（反式作用因子）结合的区域，与蛋白质结合之后，基因的转录作用将会得到加强。

二、简答题（40分）

1.简要回顾人类对基因的研究与认识过程并根据你的见解给基因下一个定义。

（1）1866

（2）1902年萨顿和鲍维里提出：遗传的染色体学说，第一次把遗传物质和染色体联系起来。

（3）1909年 （4）1926单位”。

20世纪

基因一种酶”和“一个基因一条多肽链” ，大大促进了分子遗传学的发展。

质上这一基因功能的关键课题在60年代至70年代才得以解决。从此根据基因功能把基因分为结构基因、调节基因和操纵基因。

具重叠性；管家基因和奢侈基因；基因的游动性等。

基因：也称为遗传因子，指贮存RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。它是携带有遗传信息的是控制性状的基本遗传单位。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。

2.根据 DNA复性动力学研究，DNA序列可以分成哪几种类型？并加以举例说明。

（1）单拷贝序列：又称非重复序列，在一个基因组中只有一个拷贝，真核生物的大多数基因都是单拷贝的。在复性动力学中对应于慢复性组分。

（2）轻度重复序列：在一个基因组中有2~10个拷贝（有时被视为非重复序列），如组蛋白基因和酵母rRNA基因。在复性动力学中也对应于慢复性组分。

（3）中度重复序列：有十至几百个拷贝，一般是不编码的序列，例如人类基因组中的Alu序列等。中度重复序列可能在基因表达调控中起重要作用，包括DNA复制的起始、开启或关闭基因的活性、促进或终止转录等。平均长度约300bp，它们在一起构成了基因序列家族与非重复序列相间排列。对应于中间复性组分。

（4）高度重复序列：有几百到几百万个拷贝，是一些重复数百次的基因，如rRNA基因和某些tRNA基因，而大多数是重复程度更高的序列，如卫星DNA等。高度重复序列对应于快复性组分。

3.何谓RNA剪接，何谓RNA编辑？

RNA剪接（RNA splicing）：指从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。

RNA编辑(RNA editing)：指在mRNA水平上改变遗传信息的过程。RNA编辑是通过比较成熟的mRNA与相应基因的编码信息时发现的，成熟的mRNA序列中有几种意想不到的变化，包括U→C，C→U；U的插入或缺失、多个G或C的插入等。最早是在锥虫(Trypanosome)线粒体基因中发现的。

4.什么是正调控与负调控，试举例说明。

正调控(positive regulation)：指任何促进转录的调节。

如：基因转录是DNA到RNA的过程，它是通过RNA聚合酶，接在DNA上，然后将RNA单体聚合成链。那么RNA聚合酶是怎么接在正确的位置的呢？首先，DNA的编码序列前的一段序列中有一些特殊的短序列比如TATA框，由于他们空间结构特殊，所以RNA聚合酶，可以通过转录因子识别这些短序列，使自己接在正确的位置。 其中,有的短序列可让RNA聚合酶更容易接合，从而使后面的编码更多的转录，就是正调控；而有的短序列则使RNA聚合酶不易链接，或者脱落，从而导致转录水平下降，就是夫调控。

DNA甲基化：是指在DNA甲基化转移酶的作用下,在基因组CPG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共价键结合一个甲基基因。其主要形式为5－甲基胞嘧啶（5-mC）、少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤（7-mG）。 DNA甲基化的检测方法：

（1）重亚硫酸盐(亚硫酸氢盐)修饰：未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶；甲基化的胞嘧啶不发生变化。Tube 1)；甲基化引物对 （2）用甲基化特异性引物对进行PCR扩增：未甲基化引物对(“U”primers,

(“M”primer, Tube 2)。

DNA甲基化的生物学效应：能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。 5.什么是DNA甲基化? 简要说明甲基化的检测方法及其生物学效应。

6.简述空转反应的形成及其结果。

空转反应的形成机理:当空载tRNA进入A位点时，不但不能形成新的肽键（使核糖体上的蛋白质合成被阻断），反而造成GTP的大量消耗，核糖体便开始产生鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸（pppGpp），从而诱发应急型反应。(细胞内出现空转效应时，就发出一种报警信号, 就是ppGpp和pppGpp，它们能通过某种方式控制细胞的许多生理过程，以使细胞能够适应有限的营养条件，特别是氨基酸的供应。

7.简述突变热点的定义及其可能的机制。

基因突变热点：简单的讲，就是突变几率较高的碱基序列。即DNA分子某些部位的突变频率大大高于平均数。 可能的机制：

（1）5－甲基胞嘧啶（MeC）的存在，MeC脱氨氧化后生成T，引起G－MeC→A-T转换； （2）短的连续重复顺序处容易发生插入或缺失突变；

（3）有的与突变剂种类有关，如DNA顺序中某个碱基对突变剂更敏感，有的则相反。

8.简述同源重组的机理。

同源重组（Homologus

Recombination):是指发生在姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

下面以Holliday结构说明同源重组的机理:

同源的非姊妹染色单体间

三、应用题（30分，前5题中任选2题）

1.请设计一个实验证明某基因存在一个内含子？

因线性表达的序列。DNA上的内含子会被转录到前体RNA中，但RNA上的内含子会在RNA离开细胞核而进行转译前被剪除。

2.假设从一种生物抽提了核酸，你将用什么简便的方法，区别它是DNA或RNA？

（1）利用吸光值的差异：DNA和RNA对光的吸收能力有差异，在260nm处DNA吸收峰值高于RNA，因此可以在260nm做他们的吸收光谱，以加以区分。

（2）利用甲基绿和吡罗红：因为两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿使DNA呈现绿色，吡罗红使RNA呈现红色，由此加以区分。

（3）利用DNA酶和RNA酶：DNA酶只能水解DNA，而不能水解RNA；RNA酶只能水解RNA，而不能水解DNA。由此可通过水解的程度加以区分。

3.请设计一个实验来证明DNA复制是以半保留方式进行的？

1957年由Mathew Meselson和Franklin Stahl设计。

(1)把大肠杆菌培养在含有单一氮源15N的培养基上培养多代后，DNA呈重密度；

(2)转移到仅含有14N的培养基上增殖一代；

(3)从这些细胞制备的DNA在CSCl梯度离心中形成一条带，它的密度表明这些DNA分子为一条含15N和另一条含14N的杂合链；

(4)让细胞再在14N介质中增殖两代，提取的DNA在CSCl中形成两条带，一条是重、轻的杂和链，另一条为纯轻链。

由此证明DNA复制是半保留的不是全保留的。

4.请设计一个实验确定某基因的启动子区？ （1）利用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因，对启动子在受体细胞中调控基因表达的活性进行检测：采用基因枪法对受试细胞进行遗传转化，培养24h后在荧光显微镜下观察GFP基因的表达情况，并通过软件测定不同培养条件下GFP基因表达后的荧光强度，以较为准确的鉴定该启动子的活性大小，并达到鉴定与量化的目的。—GFP是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白，GFP在其他原核或真核细胞中，在紫外光或蓝光激发下都发出绿光，即发射团的形成无物种特异性，也不需要特异的辅助因子。

（2）利用核酸酶S1作图：三种不同的核酸酶—S1核酸酶、RNA酶、外切核酸酶VII可用来进行RNA定量，确定内含子位置及鉴定在克隆的DNA模板上mRNA的5`-末端和3`-末端的位置。含有目的mRNA的RNA样品与互补的DNA或RNA探针在利于形成杂合体的条件下温育。在反应末期，用核酸酶降解未杂合的单链RNA和DNA，余下的DNA-RNA或RNA-RNA杂合体用凝胶电泳分离，接着用自显影进行观察。当探针的摩尔数在杂交反应中过量时，信号强度与样品中目的mRNA的浓度成正比。可利用过量探针与系列定量的靶序列杂交作出标准曲线，从而准确估算出样品浓度。在真核系统中，S1核酸酶消化过的5`-末端通常代表转录起始点，而3`-末端代表聚腺苷酸化的位点。同样的策略可用来对拼接位点的5`-末端和3`-末端作图。

5.设计一个实验证明某基因存在选择性剪切？ 选择性剪切：是基因工程的基础方法，应用的是限制性内切酶，因为酶具有专业性，可以在一条DNA或RNA母链中根据人类意愿剪取一段目的基因。选择性剪接形式多样，常见的主要是以下几种：1）外显子跳过，导致外显子保留或不保留在成熟的mRNA中；2）外显子具有多个可变使用的5’或3’剪接位点；3）单个或多个选择性剪接外显子可以位于组成性外显子中，以便选择性外显子可以有选择的保留或不保留于成熟的mRNA中；4）内含子不剪切，内含子可以选择性保留在成熟mRNA中以便被翻译出来。——通过剪切特定的DNA片段导入载体中再导入受体，后通过细胞培养技术，可得到有特定性状的个体。 实验方法：因选择性剪切的mRNA在剪切的接合处有特定序列，因此可以使用一种定位序列来逐个分析剪切异构物。首先可以向该基因中插入几个核苷酸，然后对该基因进行深度测序，最后将测得数据与剪接点进行比对。

6.举出2-3种基因组测序或功能基因组研究的策略，并加以说明？

（1）Sanger sequencing（sanger测序 即Sanger（1977）发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法。它根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。

Sanger法测序的原理是：每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

（2）（焦磷酸测序 是一种对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术。是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应, ），在每一轮测序反应中，只加入一种三磷酸脱氧核(糖核)苷（dNTP），若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。（然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。） 焦磷酸测序的原理是：

第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光(素)酶、腺苷三磷酸双磷酸酶)和底物混合物(包括腺苷酰硫酸APS和荧光素。

第2步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。

第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。

第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。

第5步：加入另一种dNTP，使第2-4步反应重复进行，根据所获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

（3）454 sequencing（454测序 由454生物科学发明，它使用类似于焦磷酸测序的方法，是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，首先将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光信号释放的有无和强度，以达到实时测定DNA序列的目的。454的特点不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分

目前在DNA和RNA以及甲基化等方面的应用广泛。

Solexa法测序的原理是：首先将 DNA 从细胞中提取，然后将其打断到约 100-200bp 大小，再将接头连接到片段上，经 PCR 扩增后制成 Library 。随后在含有接头的芯片上将已加入接头的 DNA 片段绑定在 flow cell 上，经反应，将不同片段扩增。在下一步反应中，四种荧光标记的染料应用边合成边测序的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集， CCD 快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。 （5）（SOLiD测序其全称为Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection，它是通过寡核苷酸连接和检测来进行测序的方法。与聚合酶测序方法不同的是，SOLiD系统通过连接酶（而不是聚合酶读取序列）并利用专利的逐步连接（stepwise ligation）技术来产生高质量的数据，可应用于全基因组测序、染色质免疫共沉淀（ChIP）、微生物测序、数字核型分析、临床测序、基因型分析、基因表达分析和小分子RNA的发现等等。SOLiD测序的化学及读出过程与Sanger测序及其他边合成边测序方法不同。 SOLiD技术采用四色荧光标记寡核苷酸进行连续连接合成代替聚合酶链接反应 SOLiD法测序的原理是：

为基础，取代了传统的聚合酶连接反应，可对单拷贝DNA片断进行大规模扩增和高通量并行测序。这种替代能够明显减少因碱基错配而出现的错误，消除相位不同步的问题，以获得更高的保真度。另外，SOLiD系统采用末端配对分析和双碱基编码技术，在测序过程中对每个碱基判读两遍，从而减少原始数据错误，以提供内在的校对功能，它是目前新一代基因分析技术中准确度最高的。SOLiD的特点在于其无可比拟的高通量（每轮运行可产生超过40亿碱基的可定位数据）、可扩展性（开放式的上样玻片格式和灵活可变的磁珠密度可通过更新操作流程来提高检测通量）、精确性（原始碱基数据的准确度达到99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可高达99.999%）、方便性（实时跟踪运行状态，允许在多个步骤中重新进入流程）和运用灵活性（鉴于以上的诸多优势，所以它应用范围十分广泛）。