重组质粒快速抽提的方法

重组质粒DNA 的小量快速制备方法

（一） Lysis Trition 发抽提方法

1. 在LB 肉汤中（含适量抗生素）接种适量的菌种，37℃振荡培养过夜。

2. 将培养物倒入离心管，2000～2500rpm 离心10分钟，尽弃上清夜，收集沉淀。

3. 加入Lysis Sucrose 液250ul, 旋涡器上振荡使沉淀分散均匀，冰浴10分钟。

4. 加入Lysozyme 液(10mg/ml)25ul,旋涡器上振荡混匀，冰浴5分钟。

5. 加入0.25M EDTA液25ul ，旋涡器上振荡振荡混匀，冰浴5分钟。

6. 加入Lysis Trition 液125ul, 轻摇混匀，室温下作用2～15分钟，待裂解后，13，000rpm, 4℃离心15分钟，取上清。

7. 在上清液中加入饱和酚150ul ，来回颠倒数分钟，12，000rpm,4℃离心5分钟，取上清液。

8. 在上清液中加入饱和酚、氯仿各150ul ，来回颠倒数分钟，12，000rpm,4℃离心5分钟，取上清液。

9. 在上清液中加入氯仿150ul ，来回颠倒数分钟，12，000rpm,4℃离心5分钟，取上清液。

10. 在上清液中加入2倍量的异丙醇或95%的乙醇（-20℃预冷），作用一定时间后， 12，000rpm, 4℃离心20～25分钟，弃上清液。

11. 干燥沉淀。

12. 加入1ml70%乙醇，来回颠倒数次，12，000rpm,4℃离心5分钟，弃上清液

13. 真空干燥沉淀。

加入TE （ph8.0）20～50ul 溶解沉淀，4℃或-20℃保存。

附：小量快速抽提中的注意事项：

1.TritonX-100 溶解细菌的脂质层，在细菌脂质上打孔呈蜂窝状。

EDTA 络合DNA 酶的络合剂。

蔗糖 提供了酶作用的环境。

溶菌酶 用以溶解细菌的膜。

2. 溶解时，若溶解过头用酚/氯仿进行纯化DNA 时不易抽出蛋白质。大量制备时常用碱裂解法。

3. 酚使蛋白质变性，用氯仿萃取蛋白质，每次吸取上清时要注意不要吸入蛋白质、酚、氯仿，否则会影酶切效果。

4. 本实验中用的氯仿系氯仿与异戊醇的混合物（24：1）。

5. 最后进行干燥，可以用自然干燥，也可抽滤干燥（约30分钟）但必须充分干燥，否 则不易于被TE 所溶解和酶切。

6. 实验前准备中将转染了质粒的大肠杆菌接种于LB 肉汤时，铂耳不宜太烫，每次最后 接种环在试管壁轻轻敲打数次，以保证有效接种，摇振培养时试管的倾斜率、水位、温度都要作适当的选择，否则不宜培养。

（二） 碱裂解法

1. 将2ml 含相应抗生素的LB 加入到容量为1.5ml 并且通风良好（不盖紧）的试管中，然后接种入一单个菌落，于37℃振荡培养过夜。

2．将1.5ml 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12，000rmp 离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。

3. 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

备注：除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面，当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空去附于管壁上的液滴。

4. 将细菌沉淀重悬于100ul 用冰预冷的溶液1中，剧烈振荡。

溶液1：50mMol/L葡萄糖,25mM Tris.HCl(pH8.0),10mM EDTA(pH8.0)。可以成批地配制，每瓶约100ml ，在10磅高压灭菌15分钟，贮存于4℃。须使细菌沉淀在溶液1中完全分散，将两个微量离心管的底部互相接触同时进行振荡，可使沉淀迅速分散。

5. 加入200ul 新配制的溶液2，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，应确保离心管的整个内表面与溶液2接触，不要振荡，将其置于冰上。

溶液2：0.2Mol/L NaOH(临用时用10Mol/L的贮存液现配)1%SDS。

6. 加150ul 用冰预冷的溶液3，（溶液3：5Mol/L 乙酸钾 60ml,冰醋酸11.5ml, 水28.5ml 配成溶液对K + 3M，对乙酸根是5Mol ）盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10秒钟使溶液3在粘

稠的细菌裂解物中分散均匀之后将管倒置于冰上3～5分钟。

7. 用微型离心机4℃12，000rmp ，离心5分钟，将上清转移到另一离心管中。

8. 可做可不做，加等量酚：氯仿，振荡混匀，用微量离心机于4℃12，000rmp ，离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。

9．用2倍体积的乙醇于室温沉淀DNA ，振荡混合，于室温放置2分钟。

10. 用微量离心机4℃，12，000rmp ，离心5分钟。

11. 小心吸去上清，ᰆ㦻ῃ㮡ᰆ置于纸巾上，以使所有液体流出，再将吸附于管壁的液滴除尽。

12. 用1ml70% 乙醇于4℃洗涤双链DNA 沉淀，按步骤8所示方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。

13. 用50ul 含无DNA 酶的胰RNA 酶（20ug/ml）的TE 重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃。

（三） 煮沸法制备质粒DNA

试剂：TETS 溶液：Tris-Hcl 10mM， TritonX-100 0.5%，EDTA 50mM,蔗糖8%。

溶菌酶溶液：Tris-Hcl 10Mm（Ph8.0）, 溶菌酶10mg/ml。

Rnase-A溶液：用前80℃处理10分钟，Tris-Hcl 10mM ，EDTA 1mM （Ph8.0），Rnase-A 50ug/ml。

方法：1. 将没一个菌种接种于5mlLB 肉汤中，并加入合适的抗生素（根据重组质粒的抗性）于37℃振荡培养过夜。

2.取1.5ml 上述液至Eppendorf 管中（剩余4℃保存），8000rpm 离心5分钟，弃上清。

3.沉淀重悬于0.35mlTETS 溶液中，加入25ul 新配制的溶菌，混匀3秒钟以后将Eppendorf 管放入沸水40秒。

4.1800rmp离心10分钟，取上清至Eppendorf 管中，加420ul 异丙醇和40ul 的醋酸钠溶液，混匀并于乙醇干冰浴中15分钟，4℃，18000rmp 离心15分钟。

5.弃上清，加入50ul Rnase-A溶液，37℃作用10分钟。

6.取10ul 制品加入干净的Eppendorf 管中，在加1.2ul 合适的10×酶缓冲溶液，再加入1～2单位的限制性内切酶，电泳，观察。

7.剩余样品-20℃保存。