液相色谱法分离几种酸性化合物的探究

液相色谱法分离几种酸性化合物的探究

金敬鹏 王嘉希 蔡文静 王志强 唐晓彤

武汉 武汉大学化学与分子科学学院 430072

摘要：建立了用HPLC 分离硫脲、苯甲酸、水杨酸、对氨基水杨酸、对羟基苯甲酸等五种

物质的分离条件，即40%体积甲醇与60%体积磷酸缓冲液，其中磷酸缓冲液为1mol/L，pH 为3.0，淋洗剂最终pH3.5，在反向键合硅胶柱为固定相，以230nm 为检测波长，得到了较好的分离效果。并讨论了优化条件实验结果的影响。

关键词：高效液相色谱法 芳香族羧酸 优化条件

Abstract : build up the HPLC separation for thiourea, benzoic acid, salicylic acid, p-hydroxide

benzoic acid, p-amino salicylic acid to alcohol and their separation conditions, witch is 40% volume methanol and 60% volume phosphate buffer, including phosphate buffer 1 mol/L, pH 3.0, and drench lotion final pH lower than 3.5, in reverse bonded silica gel column for stationary phase, with 230nm wavelength for detection and finally obtained a good separation effect. What’s more, discussed the optimization condition for the influence of experimental results.

芳香族羧酸的应用领域非常广泛，在许多药品、食品以及化妆品中都含有一定量的一种或多种芳香族羧酸或其衍生物。但因其存在毒害性，对其在相关产品中的用量有严格的规定，为了满足制造工艺及控制质量的要求，须了解产品中各种芳香酸的实际含量，因此, 建立准确、简便的芳香族羧酸的分析方法十分必要。本实验通过对五种物质的分离，提供了一种可行的方案。

1. 方法概述：

目前，文献报道分析芳香族羧酸的方法主要有气相色谱法(Gas Chromatography，GC) ，离子色谱法(Ion Chromatography，IC) ，离子排斥色谱法(Ion-Exclusion Chromatography，IEC) ，毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis ，CE) ，高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography ，HPLC) 以及高效液相色谱一质谱联用法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrum，HPLC-Ms) [1]。本实验采用较为广泛的HPLC 法。

1.1高效液相色谱法：高效液相色谱法同时具备分离效率高、灵敏度高和重现性好等优点，应用比较广泛。在近年的文献中多有报道，具有较好的应用前景。

1.2条件控制：对色谱法而言，条件选择及其控制极为重要，高效液相色谱法中，分离效果受多种因素影响主要有：

①紫外检测波长的选择：芳香羧酸由于苯环的存在通常在紫外波段具有较好的吸收，硫脲在此区域也存在吸收，故实验采用此外吸收检测器。但由于羧酸种类不同，导致各物质在具体吸收谱图存在差异，采用不同的吸收波长将会有不同的实验效果。

②流动相与固定相的选择：色谱法的重点在于用不同的流动相和固定相使样品分离，即各物质在固定相与流动相的分配比例，本实验中提供C-18反向键合硅胶柱，不在探讨范围内，实验流动相主要成分为甲醇-水体系，通过极性的改变而改变各成分保留值。

③流动相pH 值的选择：由于本实验主要分离羧酸类物质，都具有一定酸性，不同pH 环境下将有不同程度的解离，从而有不同的保留现象，这点在优化实验方案中极为重要。实际实验过程中，用磷酸盐缓冲体系代替水调节pH ，找到最佳条件。由于用磷酸缓冲体系代替水，改变比例时将会使pH 随之改变，故实际上两个条件同时改变。

1. 3 实验药品均为分析纯，配成5mg/mL甲醇溶液作为母液。

2. 实验内容

由于实验时间的限制，本实验未能采用控制变量的方法逐步确定最佳实验条件，由以上分析，采用逐步优化的方法，也得到了令人满意的结果。

2.1 检测波长：由参考文献的实验结果，改254nm 的检测波长为230nm 。 2.2 流动相条件优化：

①初步调节：初始条件为甲醇-水90:10的中性溶液，对氨基水杨酸0.1mg/mL，对羟基苯甲酸0.02mg/mL，水杨酸0.05mg/mL，硫脲0.01mg/mL，苯甲酸0.1mg/mL，得到谱图1：

[***********]502000

[***********]25001. 716/6641027

1750

2. 053/70967410

mV

8. 081/1676962

4. 085/40550

图一：甲醇-水90:10的中性溶液谱图

1600

[***********][***********][**************]0

1. 784/9762142

2. 218/26209623

2. 731/2337414

4. 006/13739693

5. 737/47553224

mV

min

图二：甲醇-磷酸缓冲液50:50（最终淋洗剂pH4.5）谱图

可以看到，图一中各组分基本没有分离。

改变条件：甲醇-1mol/L，pH 为4磷酸缓冲液50:50，得到谱图2（如上）： 可以看到部分组分已经完全分离，但仍有未分离组分。

②单样测定：以备确定各峰成分并调节单样用量以使峰面积基本一致，故先采用与上混样各成分浓度相同的单样进行检测，得到结果列于表一： 表一：甲醇-磷酸缓冲液50:50（最终淋洗剂pH4.5）单样保留行为

③依据单样保留行为重新得到混样进行检测：与上述条件相同下，得到谱图3：

1000

900

2. 159/69197022. 324/5040225

2. 709/10637931

800

1. 737/14240577

1100

mV

700

600

500

400

300

200

100

03. 946/11987787

5. 648/11881049

图三：甲醇-磷酸缓冲液50:50（最终淋洗剂pH4.5），调整浓度后谱图

调整后浓度：对氨基水杨酸0.05mg/mL，对羟基苯甲酸0.10mg/mL，水杨酸0.05mg/mL，硫脲0.025mg/mL，苯甲酸0.025mg/mL。可以看到，峰面积基本一致，已基本可以分离。

④进一步优化：将磷酸缓冲液原pH 改为3，甲醇-磷酸缓冲液50:50，进行测试，得到谱图4：

[***********][***********]

2. 030/6775487

mV

2. 866/5512765

3. 076/36738253. 382/9083749

7. 491/8287784

4. 661/54324

5. 095/12668

1. 449/3331

1007550250-250.0

1.0

5. 683/1326

6. 618/1502

9. 406/7411176

2.03.04.05.06.07.08.09.010.011.0min

图四：甲醇-磷酸缓冲液50:50（最终淋洗剂pH3.5）谱图

可以看到，调节的效果并不明显，只是增加了保留时间，说明此时pH 已不是控制因素。 ⑤改变甲醇-水比例：由以上实验，最后改变流动相比例，同时将各组分均稀释一倍，得到谱图5：

mV 550

[***********][1**********]0-50

图五：甲醇-磷酸缓冲液40:60（最终淋洗剂pH3.1）谱图

从图中可以看到，所有组分已经实现完全分离。其中各组分保留数据列于表二：

表二：实验结果

3. 实验讨论：

3.1 pH的影响，由于本实验多数物质为羧酸类，有一定的酸性且酸性各不相同，故pH 对实验结果影响十分明显，若不进行酸化，则各物质均会有明显的拖尾现象，影响实验结果的准确性，而不同的酸性以及硫脲的存在使得淋洗剂酸性不能过强，否则形成佯盐，又使组分物质带电而影响实验结果。

附：各酸性物质离解常数：

从现象线上看，当pH 值降低时，峰形趋向集中，即拖尾现象得到改善。同时，硫脲为中性物质，但在实验结果为保留时间最短，可以说明在弱酸环境中，硫脲结合一个质子而呈电正性反而保留时间最短。说明了pH 调节对实验结果的重大影响。

当pH 从4.5变为3.5时，分离效果并未得到明显提高，说明此时pH 已不是控制因素，若继续降低降低pH 并不能改善分离效果，反而此时会增加保留时间，增加试验成本，故本实验pH 调节在3-4之间即可。

pH 主要调节拖尾峰形，并对中性物质改变保留行为，但对物质分离作用并不明显。 3.2 流动相极性的影响，本实验HPLC 分离主要原理即为不同极性的淋洗剂对物质有不同的保留行为，关键即在极性调节，本实验极性比例由甲醇含量90，到50，再到40，可以看到分离效果有了明显提升。

极性较低时，所有物质保留时间均在3min 之前，完全达不到分离效果，增加极性后，在50:50的淋洗剂下，已能使保留性质最相近的两种物质分离度在0.5以上，而在40:60的淋洗剂条件下则可以使各组分完全分离，分离度最低也在2以上。说明调节极性是最主要的调节措施。

同时可以观察到，极性的增加使保留时间延长，增加了试验成本，综合实验结果，本实验在甲醇与水比例为40:60时即可达到分离效果。

3.3 肩峰，实验中出现了明显的肩峰，甚至肩峰成为劈叉峰，由于排除了物质不纯，未分离的可能，拟探讨原因如下：

①柱子老化与缺陷，由于可能存在的柱子老化与缺陷原因，使柱效并不能平均分配于各个部分，但进样样品均匀分布，从而产生保留时间差产生肩峰。

②对比谱图，可以发现，随着pH 降低，肩峰现象更加明显，而组分中出现肩峰的各物质均为羧酸，硫脲没有这样的现象，故而，肩峰的出现应当与酸性有关。应当在疏水作用外还有其他作用力存在。

3.4 保留时间，如上所述，除外部因素对实验保留时间有影响外，从实验结果可以看到，保留时间主要影响因素是物质极性，极性越大则保留时间越短，但极性不是唯一因素，在较高强度的酸度下，硫脲作为中性物质，其保留时间最短，说明了pH 的调节结果。

4. 结论：本实验用HPLC 分离硫脲、苯甲酸、水杨酸、对氨基水杨酸、对羟基苯甲酸等五

种物质，得到可行分离条件为40%体积甲醇与60%体积磷酸缓冲液，其中磷酸缓冲液为1mol/L，pH 为3.0，淋洗剂最终pH3.1，以C-18反向键合硅胶柱为固定相，以230nm 为检测波长，得到了较好的分离效果。

5. 参考文献：

[1]. 徐烨，张春妮，曹轶男，徐梵姝，王乃芝. HPLC 法同时测定尿样中芳香族化合物的6种代谢产物 [J] 分析测试学报2011，30(9)。

[2]. 许丽丽，李来生，杨汉荣，刘妙芬. 姜黄素键合硅胶固定相高效液相色谱分离取代芳香酸类化合物 [J] 分析科学学报2008，24(1)。

[3]. 董影杰. 高效液相色谱分析芳香族梭酸及其离子液体的应用[D]. 哈尔; 宾. 哈尔; 宾师范大学 2011.6。

[4]. 武汉大学 主编，分析化学 下册 [M] ，北京 高等教育出版社，2007.12。

（第五版）