外周血淋巴细胞染色体制备与分析技术规范
外周血染色体制备与分析技术规范 原理：
在正常情况下，人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。植物血球凝集素（PHA ）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA 作用下，原处于Go 期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。利用PHA 这一特性，淋巴细胞经过含有HPA 培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，例可得到所需的人体染色体图形。具有用血量少、操作简单等优点。
1、实验材料
2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL 、甲醇、冰醋酸、载玻片等。
2、培养液配制
无菌条件下配制培养液，每瓶所含下列试剂： RPMI 1640或199 90%
小牛血清 10%
PHA （自制） 0.1ml 3%
肝素 10u/ml 2%
双抗 100u/ml（选择）
分装于10ml 培养瓶内，每瓶5ml 培养液，封口置冷藏柜备用。
3、植物油凝素的制备
植物血凝素也称为植物凝集素（PHA ），可自制也可购自商品。自制的方法常用生理盐水提取法。
（A ）干品制备法
（1）选广东鸡子豆10g ，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。恒温箱内24-48小时；
（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml ，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml ，再置4℃冰箱内24小时。每8-12小时摇荡一次。（也可一次性加100ml 生理盐水）；
（3）无菌条件下移入10-50ml 离心管内，3000-4000rpm30分钟。在无菌箱内把上清液分装于10ml 小瓶，置冰箱冷冻层备用；
（4）效价：外周血染色体制备每100ml 培养基加PHA 约2ml 。注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。
（B ）鲜品制备法：
（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g ，用75%酒精浸泡10分钟；
（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml 无菌盐水浸泡封口；
（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml 小瓶内，置冰箱冷冻层备用。
（4）效价：正式使用前先用一定量作效价测定，按效价使用。 检查人染色体的数目、结构是否正常。
4、标本要求
（1）标本类型：全血。
（2）标本要求：新鲜，无脂血，无溶血。
（3）标本拒收状态：细菌污染，严重溶血或脂血标本不能作测定。
5、操作过程
（1）采样接种：用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶盖，用酒精灯火焰过烤，无菌条件下抽取患者外周血0.5-1ml ，每瓶加20滴左右，轻摇均匀，尽量避免培养物与瓶盖接触；
（2）培养：置36℃培养箱中培养72小时，每隔12小时左右轻遥1次，以促进细胞生长增殖；
（3）抑止分裂：收获前2小时左右加秋水仙素，最终浓度为0.02ug/ml培养液，摇匀后置培养箱中继续培养，以抑止细胞在分裂中期。
（4）终止培养：从培养箱中取出培养瓶，摇匀后移至10ml 尖底离心管中，尽量收集培养细胞。2000rpm8分钟。
（5）低渗处理：弃上清液，加入预温37℃的0.075MKCL8ml ，迅速打匀，置37℃培养箱或水浴锅中10-20分钟；（
6）预固定：取出低渗中尖底离心管，轻轻加入新配制的1-2ml 3∶2甲醇：冰乙酸混合液，取相应编号滴管用汽泡轻轻软打2-3下。800-1000rpm8-10分钟；
（7）固定：弃上清液。加入新鲜配制的3∶2甲醇冰乙酸混合液10ml ，轻打混匀，封口置室温30分钟以上。1500-2000rpm10分钟，反复2-3次；
（8）制片：使用蒸馏水制备冰水片进行滴片。留离心后沉淀细胞，加新鲜配制的固定液，制成细胞悬液，取1-2滴滴片，用于轻轻吹开。刻号后清理刻号污物，置80℃烤片2小时；
（9）收片：待烤箱自然冷却后，取出烤片，置干净环境中或培养箱中以备进行显带处理。