氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞
氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞
实验原理
转化是将外源基因引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性改变,成为允许外源DNA分子进入的状态,这种细胞称为感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl法。制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油,并于-70℃保存。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUC18质粒共保温,实现转化。由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Amp),可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC18,则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了pUC18。转化子扩增后,可将转化的质粒提出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。
实验方法
一、材料
DH5a菌种(生工),3ml不含抗生素的LB液体培养基,100ml不含抗生素的LB液体培养基 ,盐酸,三羟甲基氨基甲烷(Tris碱),CaCl2,2块氨苄抗性LB固体培养基,2块卡纳抗性LB固体培养基,2块无抗性LB固体培养基,甘油。
二、设备
移液枪(20μl,200μl,1000μl),50ml离心管4支,对应离心管转子,0.45um针头滤器,30ml注射器,烧杯,量筒,容量瓶,锥形瓶,冰浴。
三、试剂准备
1. LB培养基300ml:胰化蛋白胨3g,酵母提取物1.5g,NaCl3g,290ml去离子水,加
入10mol/L NaOH,每次5μl,比对PH试纸至PH7.0左右。
1) 分装出100ml LB液体培养基(不含抗生素)。
2) 分装3支3ml的液体培养基。
3) 其余200ml用于制备LB固体培养基:分装3个50ml,分别加入0.75g细菌培养用琼
脂。
4) 高压后降温至65℃,制备2块氨苄抗性LB固体培养基(加48μl氨苄抗生素),2块
卡纳抗性LB固体培养基(加200μl卡纳抗生素),2块无抗性LB固体培养基。
2. 将准备好的LB培养基,甘油,2个50ml离心管,80个1.5ml离心管,高压。
3. Tris-CaCl2 500ml(75mmol/L CaCl2,10mmol/LTris.Cl,pH6.5):称取CaCl24.1621g,
Tris0.6057g,先在烧杯中加约200ml的ddH2O用磁力搅拌器混匀,然后再加ddH2O定容至500ml,用盐酸调至pH6.5,最后再将配制好的Tris-CaCl2吸入30ml注射器中并经0.45um针头滤器过滤,方可得到最终的Tris-CaCl2500ml(75mmol/L CaCl2,10mmol/LTris.Cl,pH6.5)溶液。
4. 卡那霉素:10mg/ml溶于水,工作浓度50μg/ml,3ml菌液加大约15μl卡那(1ml
菌液加大约5μl卡那),以水为溶剂的抗生素储存液应用0.22μm滤器过滤除菌。
5. 氨苄青霉素:50mg/ml溶于水,工作浓度60μg/ml,3ml菌液加大约4μlAmp(1ml菌
液加大约1.2μlAmp)。
四、操作步骤
1.受体菌培养:
1) 无菌接种环刮取冻存于-70℃的大肠杆菌菌种DH5α,划线接种于不含抗生素的LB固
体培养基上,37℃培养16h左右。
2) 挑取一单个菌落,接种于3ml 不含抗生素的LB液体培养基中,37℃下振荡培养过夜。
2.感受态细胞制备(CaCl2法):准备冰浴,预冷的Tris-CaCl2和50ml离心管,甘油,80个封口膜,80个离心管
1) 吸取2ml菌液接种于37℃预热的100mlLB液体培养基中(1:50的比例),37℃振荡
培养2.5~3h(后一个小时随时观察细菌生长情况)。
2) 无菌条件下,将培养液转入2个无菌预冷的50ml离心管中(以下操作均需无菌且在冰
浴中进行),冰浴30min,冷却至0℃。
3) 4℃,5000r/min离心10min。
4) 弃上清,倒置离心管,使残留液体流尽,使细菌悬于10ml(每个管)预冷的Tris-CaCl2
溶液中,冰浴15min。
5) 4℃下,5000r/min 离心10min。
6) 弃上清,每个管用2ml冰预冷的含15%甘油(300μl)的Tris-CaCl2保存。
7) 用无菌吸头将感受态细胞分装于无菌离心管中,50μl/每管,贮存于-70℃。
3.检测:准备冰浴,42℃水浴
1) 将10μl已有的分别含Amp,Kan的质粒转化到制得的感受态菌中。
2) 冰浴30min,42℃水浴45s(
3) 加LB培养基940μl,37℃摇床震荡培养1h。
4) 12000r/min离心1min,弃大部分上清,留200μl菌液,吹打混匀。
5) 取100μl菌液涂于培养皿上培养18h,观察结果。100μl的感受态细胞涂于无抗生素
平板上,100μlAmp质粒的感受态细胞涂于Amp平板上,100μl卡那质粒的感受态细胞涂于卡那平板上,100μlAmp质粒的感受态细胞涂于卡那平板,100μl卡那质粒的感受态细胞涂于Amp平板。