药物遗传毒性研究技术指导原则

附件四

指导原则编号：

药物遗传毒性研究技术指导原则

药物遗传毒性研究技术指导原则

一、概述

遗传毒性研究（Genotoxicity Study）是药物非临床安全性评价的重要内容，它与其他毒理学研究尤其是致癌性研究、生殖毒性研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。

遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定，一般被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤发展过程的环节之一（这种遗传学改变仅在复杂的恶性肿瘤发展变化过程中起了部分作用）。在检测此类损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在致癌剂和/或致突变剂，即可能诱导癌和/或遗传性疾病。由于在人体中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。但是，因为已经确定生殖细胞突变与人类疾病有关，所以对可能引起可遗传效应的化合物与可能引起癌症的化合物应引起同样的关注；此外，这些试验的结果可能还有助于解释致癌性的机制和试验结果。因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。

本指导原则重点阐述遗传毒性试验体内外试验的基本原则，并

介绍标准试验组合方案，以及对试验结果的综合分析及评价。

本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物的遗传毒性试验研究。

二、基本原则

（一）实验管理

药物的遗传毒性试验属于安全性评价研究，根据《中华人民共和国药品管理法》的规定，必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。

（二）具体问题具体分析

遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、适应症和适用人群特点、临床用药方案选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并综合上述信息对试验结果进行全面的分析评价。

（三）随机、对照、重复

遗传毒性试验应符合毒理学试验的基本原则，即随机、对照和重复的原则。

三、基本内容

（一）受试物

1、中药、天然药物

受试物应能充分代表临床研究受试物或上市药品，因此受试物应采用制备工艺稳定、符合临床研究质量标准规定的样品，一般用中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明批号、规格及生产厂家。

2、化学药物

受试物应采用制备工艺稳定、符合临床研究用质量标准规定的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。

（二）试验设计的总体考虑

对药物而言，需对潜在的遗传毒性进行全面评价，遗传毒性试验可用作鉴定体细胞诱变剂、生殖细胞诱变剂和潜在的致癌物。目前，遗传毒性试验方法较多，所使用的生物材料多种多样，可以利用原核细胞到真核细胞直至高等哺乳动物细胞在体外进行添加或不添加代谢活化物的试验，也可在整体动物上进行体内试验；根据试验检测的遗传终点可将检测方法分为三大类，即基因突变、染色体畸变、DNA损伤与修复；从试验系统来分，遗传毒性试验可分为体内试验和体外试验。因体内和体外试验差异较大，以下分别讨论体外试验和体内试验的基本要求。由于体内外的试验方法均较多，本指导原则仅讨论常用方法及需要重点关注的问题，具体试验时需根据具体情况具体分析。

1、体外试验基本要求

1.1 细菌回复突变试验中采用的基本菌株

在细菌回复突变试验中至少应采用5种菌株，包括用于检测组氨酸靶基因中鸟嘌呤-胞嘧啶（G-C）位点碱基臵换或移码突变的4种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（TA1535；TA1537/TA97/ TA97a（注释1）；TA98；TA100），以及用于检测组氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位点碱基臵换或移码突变的鼠伤寒沙门氏菌TA102或埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA或埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA

（pKM101）（注释2）。由于检测G-C位点突变的4种菌株无法检测交联剂，因此检测交联剂时最好采用TA102菌株或增加一种修复准确型大肠杆菌（如埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA （pKM101））。

1.2 体外试验中最高浓度的确定（注释3）

体外试验中受试物的最高浓度主要取决于受试物对细菌/细胞的毒性和溶解度。

1.2.1 无毒化合物的高浓度

对易溶解的无毒化合物，细菌试验应达到的最高浓度为5mg/皿，哺乳动物细胞试验为5mg/ml或10mM（选用较低者）。

1.2.2 要求达到的细胞毒性水平

在遗传毒性体外试验中，某些遗传毒性致癌剂只有在检测浓度高达可产生一定程度的细胞毒性时才可检出，但毒性过高又可影响对相应的遗传终点进行恰当的评价。当哺乳类动物细胞存活率很低时，一些遗传毒性以外的作用机制如细胞毒性（如与细胞凋亡、溶酶体释放核酸内切酶等有关的结果）会导致遗传毒性的假阳性结果，这种情况常发生于受试物浓度达到毒性阈浓度时。

鉴于以上情况，在体外细菌和哺乳类动物细胞试验中，目前可接受以下的细胞毒性水平（浓度不应超过1.2.1中的规定）：

（1）在细菌回复突变试验中，最高浓度应能显示明显的毒性，如回复突变数减少、背景菌斑减少或消失。

（2）哺乳动物细胞体外遗传毒性试验中，毒性水平应高于50%细胞抑制率或细胞融合率，对培养的淋巴细胞，有丝分裂指数抑制率应高于50%。

（3）哺乳动物细胞体外基因突变试验中，理想的最高浓度应能产生至少80%毒性（即存活率不大于20%）。可通过评价平板接种效

率或相对总生长率测定毒性。对于细胞存活率低于10%时获得的阳性结果，应谨慎对待。

1.2.3 难溶受试物的检测

在用细菌和哺乳动物细胞遗传毒性试验检测某些受试物时，在不溶解的浓度范围内也能检测出剂量相关性的遗传毒性（注释4）。建议采用以下策略检测相对不溶的受试物，该建议仅针对培养基中的受试物。

（1）若未观察到细胞毒性，应以产生沉淀的最低浓度作为最高浓度，但细菌试验不超过5mg/皿，哺乳动物细胞不超过5mg/ml或10mM。

（2）若观察到剂量相关性的细胞毒性或诱变性，则不管溶解度如何，应按上述1.2.2要求的毒性水平来确定最高浓度，这需要检测多个产生沉淀的浓度。但当沉淀量影响到结果观察时，则无法达到所要求的细胞毒性的剂量水平。在给药处理开始前和结束时，均应用肉眼评价沉淀量。

1.3 体外试验的重现性

体外试验应关注重现性。体外试验通常应进行重复试验。

但是，当采用标准的、已广泛应用的常规体外试验方法时，若这些试验经过了充分验证且进行了有效的内部质量控制，可不必进行重复试验，例如：对哺乳动物细胞基因突变试验，进行了规范的范围确定试验，其可提供足够的数据以保证试验方法的正确性；对体外染色体损伤的细胞遗传学试验和小鼠淋巴瘤tk试验，采用了合适的、规范的方法，如包括有阳性和阴性对照、加和不加代谢活化的试验、处理时间及采样时间合适等。在进行这些试验后，若得到明确的阳性或阴性结果，一般可不需要进行其他确证性试验；但若

得到可疑结果，则需要进一步试验。

2、体内试验基本要求

2.1 体内试验的给药途径

一般情况下，给药途径应与临床拟用途径一致。若不一致，应说明理由。

2.2 体内检测染色体断裂剂的骨髓试验

啮齿类动物骨髓有核细胞的染色体畸变试验可以检测多种染色体完整性方面的改变，该类变化几乎均来源于原发性的单个或多个染色单体断裂。如果产生了一个无着丝点片段，染色单体或染色体断裂就导致微核形成，因而检测染色体畸变或微核的方法可用于检测断裂剂（注释5）。由于细胞分裂后期的一个或多个染色体相对滞后也能形成微核，因而微核检测方法也能检测一些非整倍体诱导剂（注释6）。

总之，体内骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓嗜多染红细胞微核试验均可用于检测断裂剂。此外也可以通过测定小鼠外周血中未成熟（嗜多染）红细胞的微核率来检测断裂剂，除小鼠外，也可采用其他脾脏无法清除带微核的红细胞或对断裂剂或非整倍体诱导剂有足够灵敏度的动物。

2.3 骨髓微核试验中啮齿类动物性别的选择

对小鼠微核试验检测已知断裂剂的许多研究表明，通常雄性小鼠比雌性小鼠对诱导微核更敏感，二者之间仅有量的差异而无质的差异，但若性别间存在显著的量的差别则会导致性别间的毒性不同。若性别间代谢产物有明显的质的差别，则应采用二种性别的动物。类似的原则同样适用于其他体内试验方法（注释7）。骨髓微核试验可采用小鼠或大鼠。

总之，在微核试验中，除非性别间在毒性或代谢方面有明显差异，一般单用雄性动物即可。如果受试物专用于一种性别，则通常选用相应性别的动物进行试验。

（三）标准试验组合

遗传毒性试验方法有多种，但没有任何单一试验方法能检测出所有的遗传毒性物质，因此，通常采用体外和体内遗传毒性试验组合的方法，以减少遗传毒性物质的假阴性结果。这些试验相互补充，对结果的判断应综合考虑。

1、标准试验组合应具备的特征

标准试验组合应反映不同遗传终点，包括体内和体外试验，从原核到真核细胞，因此应包含以下内容：

（1）应包含细菌回复突变试验，因为该试验已被证明能检出相关的遗传学改变和大部分啮齿类动物遗传毒性致癌剂。

（2）因细菌不能完全检测DNA损伤，应采用哺乳动物细胞进行评价。目前使用的几种哺乳动物细胞系有：检测染色体损伤的细胞系（染色体结构和数目畸变的体外试验）；主要检测基因突变的细胞系（注释8）；检测基因突变与染色体断裂作用的细胞系（小鼠淋巴瘤tk试验）（注释9）。现有研究表明，对于检测具有遗传毒性但在细菌回复突变试验中结果为阴性的化合物，在采用合适的试验方案条件下，检测染色体损伤的各种体外试验与小鼠淋巴瘤tk试验结果高度一致。因此，在标准试验组合中，上述试验系统可互相替换。

（3）应包含一项遗传损伤体内试验，以提供一个包括影响受试物遗传毒性作用的其他相关因素（吸收、分布、代谢、排泄）的试验模型。体内试验可另外检出某些遗传毒性物质（注释10）。可采用啮齿类动物造血细胞染色体损伤体内试验或其他合适的体内试验。

啮齿类动物染色体损伤体内试验包括骨髓细胞染色体畸变试验和骨髓细胞或外周血红细胞微核试验。

2、推荐的标准试验组合

（1）一项体外细菌基因突变试验；

（2）一项采用哺乳动物细胞进行的体外染色体损伤评估试验，或体外小鼠淋巴瘤tk试验；

（3）一项采用啮齿类动物造血细胞进行的体内染色体损伤试验。 对于结果为阴性的受试物，完成上述三项试验组合通常可提示其无遗传毒性。对于标准试验组合得到阳性结果的受试物，根据其治疗用途，可能需要进行进一步的试验。

建议采用标准试验组合并不意味着其他遗传毒性试验（如DNA加合物检测，DNA链断裂、DNA修复或重组试验）不合适，这些试验可作为标准试验组合以外的供选试验，以进一步验证或补充标准试验组合得到的遗传毒性试验结果。此外，用分子生物学技术对遗传毒性作用机制进行研究，将有利于危险度评估。在某些情况下，标准试验组合中的一项或多项试验对受试物不适合时，可采用其他替代试验，但应提供充分的科学依据。

标准试验组合不包括为检测非整倍体而设计的特定试验。但是，从体外和体内染色体损伤试验中可得到非整倍体损伤的信息，如有丝分裂指数升高、多倍体产生和微核增加；小鼠淋巴瘤tk试验对于非整倍体诱导剂的检测也能提供一些有用的信息。出现上述情况时可能需要进行进一步的试验。

附录部分简介标准试验组合中常用的几种试验方法，该部分内容只是基本原则，具体试验时需根据具体情况具体分析，设计合适的试验方法。

3、标准试验组合的调整

标准试验组合在一些特殊情况下不适合，需要根据情况进行调整。

（1）在一些情况下，细菌回复突变试验不能提供合适的或足够的信息以评价遗传毒性，如对细菌毒性过大的受试物（如某些抗生素）和可能或已知可干扰哺乳动物细胞复制的受试物（如拓扑异构酶抑制剂、核苷酸同系物或DNA代谢抑制剂）。在这种情况下，体外试验部分可改用二种不同类型细胞和二种不同终点（基因突变和染色体损伤）的体外哺乳动物细胞试验。

（2）三项标准试验组合一般可检出具有遗传毒性作用的可疑结构的受试物（注释11）。但是，对此类结构的受试物，在三项试验组合中的结果为阴性时，需要适当增加一些试验，应根据其化学性质、已知反应性和代谢资料来选择附加试验或调整实验方案。

（3）对于某些特殊的受试物，如毒代或药代动力学研究表明不被全身吸收，在标准体内遗传毒性试验中无法到达靶组织（注释12）的受试物，如放射影像剂、抗酸铝合剂和一些皮肤用药，对这些受试物，标准组合的体内试验难以提供有用的附加信息。若改变给药途径也不能提供足够的靶组织暴露时，可仅根据体外试验进行评价。

（四）与致癌试验相关的附加遗传毒性试验

1、肿瘤产生的相关证据

对于标准遗传毒性组合试验结果为阴性而在致癌试验中出现阳性结果但不能确定具有非遗传毒性作用机制的受试物，建议采用合适模型的附加遗传毒性试验。为了有助于了解作用机制，附加试验可以改变体外试验的代谢活化条件或者进行肿瘤靶器官的遗传损伤的体内试验（例如：肝UDS试验，32P-后标记试验，转基因突变测定，肿瘤相关基因遗传改变的分子特征研究）。

2、具有特异结构的化合物

在极个别情况下，具有特异结构的全新化合物可能会被开发为新药。当不进行该化合物的啮齿类动物长期致癌试验时，应该对其遗传毒性进行深入评估。

四、结果分析与评价

遗传毒性研究是药物安全性评价与药物整体开发进程的一个有机组成部分，其最终目的在于预测受试物潜在的遗传毒性或致癌性。试验结果的分析和评价是试验的必要组成部分，应对研究结果进行科学和全面的分析和评价。在对遗传毒性试验结果进行评价时，应结合受试物的药学特点、药效学、药代动力学和其他毒理学研究的结果等信息进行综合分析。中药、天然药物还应结合处方组成特点、方中药味毒性情况、临床应用背景情况等进行综合分析。试验结果的评价最终应落实到临床研究受试者范围限定、风险效益评估以及必要防治措施的制定和应用上。

遗传毒性试验组合检测的是主要通过直接的遗传损伤机制的致癌剂（如绝大多数已知的人类致癌剂），该类组合无法检测出非遗传毒性致癌剂。体外试验的一些实验条件，如有限的体外代谢活化能力，可能导致假阴性结果，但是，任何一种遗传毒性试验中的阳性结果并不一定能说明受试物对人体真正具有遗传毒性或致癌性的危险。在对体内外试验结果进行评价时，对阳性或阴性的结果均应予以充分考虑，尤其是在有疑义时。因此，需进行综合分析和评价。

（一）体外试验结果的评价

1、体外试验阳性结果

在评价体外试验阳性结果的生物学意义时，应考虑以下几个问题：（1）与阴性或溶剂对照数据及背景数据比较，是否有意义？

（2）是否有剂量相关性？（3）弱或可疑的阳性结果是否可重现？

（4）阳性结果是否由于体外独特的代谢活化途径或体外特殊的活性代谢物所致（注释13）？（5）结果是否可归因于体内不存在的体外极端培养条件，如极端的pH值、渗透压、细胞悬液中的沉淀物？（6）哺乳类动物细胞试验中，阳性结果是否仅出现在存活率极低的浓度？（7）阳性结果是否归因于某种污染物（当某些化合物不存在可疑结构或仅为弱诱变剂或仅在很高浓度时才有诱变性时，可能发生该种情形）？（8）某种特定遗传终点的试验结果是否与同类化合物中其他化合物的试验结果一致？（9）有无其他可能的情况。

通过以上考虑，综合分析该阳性结果是否有生物学意义。

2、体外试验阴性结果

在评价体外试验阴性结果时，应慎重考虑以下问题：（1）受试物的化学结构或已知代谢是否提示采用的标准体外代谢活化技术（如啮齿类动物肝脏S9）可能不合适？（2）化合物的结构或已知反应性是否提示采用其他检测方法或系统更合适？（3）有无其他可能的情况。

（二）体内试验结果的评价

与体外试验相比，体内试验方法具有考虑到与人体应用相关的吸收、分布、排泄的优点，而且体内代谢相对于体外试验中的代谢系统更具有相关性，因此，体内试验在遗传毒性试验中具有更重要的意义。一些已经确证的体内方法可用于评价遗传毒性，其中包括骨髓或外周血细胞遗传学试验。若某受试物体外试验结果为阴性，一般仅需进行一种体内细胞遗传学试验。

对于在一种或多种体外试验中显示有生物学意义的阳性结果的

受试物，在进行一种体内细胞遗传学试验的基础上，采用骨髓或外周血以外的组织进行进一步的体内试验可提供更有用的信息（注释

14）。受试物体内作用的靶细胞以及体外试验的检测终点有助于选择附加的体内试验。

如果体外与体内试验的结果不一致，对其中的差异应采用具体问题具体分析的原则进行考虑和分析。评价受试物的潜在遗传毒性时，应全面考虑各项试验结果、体内和体外试验方法的内在价值及其局限性。

1、体内试验结果阴性时，确定靶组织暴露水平的原则

体内试验结果的意义与确定受试物在靶组织（注释12）中有足够的暴露直接相关，尤其是当体外试验显示出确定的阳性结果而体内试验结果为阴性时更为重要。由于靶组织以外的组织中出现了剂量限制性的毒性，因此靶组织中通常很难达到足以诱发生物学反应（如毒性）的浓度。在这种情况下，毒代动力学资料能提示在靶组织中的暴露情况。如果由于受试物在靶组织中利用度很低或蛋白结合率高等原因以致无法达到足够的暴露量，此时常规的体内遗传毒性试验的意义较小。

以下建议适用于骨髓细胞遗传学试验，如果用其他靶组织，类似的原则也可采用。对于任何一种体外试验方法结果呈阳性、而体内试验结果为阴性的受试物，应采用以下任何一种方法反映受试物在体内的暴露水平：

（1）通过测定微核试验中在各剂量组和各采样时间点骨髓中未成熟红细胞数与红细胞总数的比例发生的显著变化，或通过测定染色体畸变试验中有丝分裂指数显著的降低，间接反映受试物的暴露水平。

（2）通过测定血液或血浆中的水平反映受试物相关物质的生物

利用度（注释15）。

（3）直接测定骨髓中的受试物相关物质。

（4）通过放射自显影检测组织暴露水平。

对于方法（2）～（4），应先在最高剂量或其他相关剂量采用与骨髓试验相同的动物种属品系及给药途径进行检测。若体外试验未显示受试物有潜在遗传毒性，可采用上述任何一种方法，也可用啮齿类动物吸收、分布、代谢和排泄试验结果来确定体内（系统）暴露水平。

2、生殖细胞诱变剂的检测

遗传毒性对生殖细胞的影响也极其重要。有关生殖细胞诱变剂检测的比较研究结果显示，大多数生殖细胞诱变剂能在体细胞试验中检出，而体内体细胞遗传毒性试验的阴性结果通常可提示受试物对生殖细胞也无影响。体内体细胞试验结果为阳性时，在综合评价及指导用药时应关注受试物对生殖细胞的影响。

（三）综合分析与评价

当遗传毒性结果为阳性时，对进入临床试验是否安全，应考虑所有的安全性资料，包括对所有遗传毒性资料的全面评价和拟进行的临床试验的性质。

如果这些遗传毒性试验的结果提示无潜在的遗传毒性，则临床研究一般可在健康受试者和拟用临床适应症的病人中进行。对于遗传毒性试验出现阳性结果、但不直接与DNA发生作用的受试物，不是全都会带来明显的体内给药的风险。因此，当遗传毒性试验出现阳性结果时，建议提供有关遗传毒性机制的证据以及这种机制与预期体内暴露的相关性，或者通过试验排除药物为非直接与DNA作用的机制，如证明受试物不使DNA烷化或DNA链断裂。若确认受试

物可直接损伤DNA，在极特殊情况下，可能会允许用于危及生命的疾病（如癌症），但不能在健康受试者中使用。

当受试物的标准三项试验组合中的任何一项试验结果为阳性时，建议完成标准试验组合中的第四种试验。若结果模棱两可，需重复试验以确定结果的可重现性。若一项或多项试验结果为阳性，需采用证据权衡法（注释16）、进行作用机制研究或附加的支持性试验（注释17）以确认受试物是否会引起遗传毒性。

五、遗传毒性研究进行的时间

通常情况下，对于（1）新的化学药物；（2）中药、天然药物中的：①新的有效成分及其制剂；②新的药材及其制剂；③新的中药材代用品；④药材新的药用部位及其制剂；⑤处方中含有无法定标准的药材，或来源于无法定标准药材的有效部位，以及用于育龄人群并可能对生殖系统产生影响的新药（如避孕药、性激素、治疗性功能障碍药、促精子生成药、保胎药或有细胞毒作用等的新药），在人体试验开始前，应完成标准组合的遗传毒性试验。若出现可疑或阳性试验结果，应进一步进行其他相关试验。

对于其他需进行遗传毒性研究的中药、天然药物，如长期毒性试验中发现有异常增生、处方中含有高度怀疑的遗传毒性的药味或成分等，应根据具体情况提供相应的遗传毒性研究资料，并根据具体情况来确定所需要进行的遗传毒性试验的内容及进行的时间。

由于中药制剂尤其是中药复方制剂有其特殊性，如含有生药粉的制剂、不溶物较多、成分复杂、溶解度较差、pH值等问题，难以进行体外试验者，可选择进行合适的体内试验，但必须充分说明理由。

六、参考文献

1. ICH Steering Committee. Harmonised Tripartite Guideline S2A：Guidance on specific aspects of regulatory genotoxicity tests. 1995

2. ICH Steering Committee. Harmonised Tripartite Guideline S2B：Genotoxicity:A standard battery for genotoxicity testing of pharmaceuticals.1997

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4. FDA. Guidance for industy and review staff: Recommended approaches to integration of genetic toxicology study results. 2006

5. 致突变试验。见：新药（西药）临床前研究指导原则汇编（药学、药理学、毒理学）。中华人民共和国卫生部药政局，1993:211-216

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10. Crutis D.Klaassen. Casarett&Doull’s Toxicology,6th edition，人民卫生出版社，2002

11. OECD Guideline for Testing of Chemicals.471Bacterial reverse mutation test.1997

12. OECD Guideline for Testing of Chemicals.473 In Vitro

Mammalian chromosome aberration test.1997

13. OECD Guideline for Testing of Chemicals.474 Mammalian erythrocyte micronucleus test.1997

14. OECD Guideline for Testing of Chemicals.476 In Vitro Mammalian cell gene mutation test.1997

七、著者

《药物遗传毒性研究技术指导原则》课题研究组。

八、相关注释

注释1：TA1537、TA97和TA97a均含有胞嘧啶的重复序列，其位于相应的组氨酸靶位点内的突变敏感部位，它们对导致这些移码热点中碱基缺失的移码诱变剂的敏感性相似，因此该三种菌株可相互代替。

注释2：有将A-T靶位点突变的菌株包含在测试组合中可检测出一些遗传毒性致癌剂的相关文献报道（如Levin等，1983；Wilcox等，1990）。日本劳务省对5525种化合物的数据库进行分析（以及由各个制药公司对较小的数据库进行分析）的结果表明，约7.5%的细菌诱变剂是由大肠杆菌WP2 uvrA而非4种鼠伤寒沙门氏菌株标准组合检出。尽管尚未获得这些化合物对动物致癌性的资料，但它们很可能具有与诱导鼠伤寒沙门氏菌株标准组合变化的诱变剂同样的潜在致癌性。

注释3：此处所指最高浓度的确定主要针对化学药物，因中药、天然药物所包含范围过宽（如有效成分类、有效部位类、中药复方类等），情况过于复杂，在合适时可参考化学药物的最高浓度的确定原则进行设计，不合适时需根据具体情况进行合理的设计。

注释4：出现这种情况可能是培养基中的血清或S9混合液成分

增加了沉淀物的溶解性，也可能是细胞膜脂质层易化了细胞对脂溶性物质的吸收；此外，某些类型的哺乳类动物细胞具有内吞噬作用（如中国仓鼠V79、CHO和CHL细胞），能摄取固态颗粒，随后将其分散于胞浆中。某些不溶性化合物也可能含有可溶性的遗传毒性杂质。并且许多不溶性药物是以混悬液或颗粒状给予人体的。但是另一方面，沉淀物可能干扰结果的观察，并使得暴露的程度难以控制（如用离心方法从暴露介质中分离细胞时），或使受试物无法进入细胞与DNA发生作用。

已发现一些物质仅在产生沉淀的浓度范围内才显示出明确的遗传毒性，这些物质包括化合物的聚合物和混合物、某些多环苯烃、某些苯丙胺、七氯化合物等。有关其中一些物质的协作研究结果表明，它们的遗传毒性在可溶范围内可被检出，但在不溶性的范围内明显增高。

注释5：因微核形成机制与诱导染色体畸变有关，微核试验及染色体畸变试验均可用于筛选断裂剂。对相同受试物的小鼠微核试验与大鼠骨髓中期相分析的比较研究表明，在定性（即检测断裂剂的能力）和定量（即确定诱导断裂的最低剂量）这两方面均高度相关。采用同种动物进行试验时，可望得到更为一致的结果。

注释6：虽然微核的形成源于受试物与纺锤体相互作用导致整条染色体分裂的滞后，但微核试验无法检测所有非整倍体诱导剂。更特异的非整倍体畸变检测方法之一即是采用快速、灵敏的技术分析个体（啮齿类动物）分裂间期核中的染色体，如原位荧光分子杂交（FISH）方法。

注释7：鉴于微核和染色体畸变的诱导具有相关性，因而用雄性动物进行骨髓染色体畸变试验时，应用相同的实验条件是合理的。

外周血微核试验和体内前处理的UDS试验一样仅在雄性啮齿类动物中得到验证。

注释8：目前被接受的评价哺乳动物细胞基因突变的试验方法包括小鼠淋巴瘤L5178Y细胞或人淋巴母细胞TK6细胞tk试验，CHO细胞、V79细胞或L5178Y细胞hprt试验，AS52细胞gpt试验。

注释9：对在tk位点诱导的突变体分子分析显示存在多种遗传学变化，包括点突变、缺失、移位、重组等。对小集落突变体分析显示tkb等位基因的缺失是染色体结构或数目的改变或重组的结果。有证据表明其他位点，如hprt或gpt也对染色体的大范围缺失敏感，但由于来源于X染色体的的hprt基因很可能位于生命必需基因（Essential genes）的侧面，染色体的大范围缺失或数目改变往往不引起突变集落，因此对于检测多种遗传学改变，该遗传位点的灵敏度不如tk位点。

注释10：有少数明显的遗传毒性致癌剂确能被骨髓染色体损伤试验检出，但在标准组合选择的几对体外试验中，如细菌回复突变试验和一项可选择的染色体损伤细胞遗传学评价试验组合，或细菌突变试验和小鼠淋巴瘤tk试验组合，却得到阴性、弱阳性或相互矛盾的结果。丙卡巴肼、氢醌、氨基甲酸乙酯、苯等致癌剂即属于此类。

注释11：某些具有遗传毒性可疑结构的分子单体与化合物的致癌和/或致突变有关。可疑结构包括烷化亲电子中心、不稳定过氧化物、芳香胺、偶氮结构、N-亚硝基基团、芳香硝基基团。

注释12：靶组织：此处特指体内试验的检测目标组织，如小鼠骨髓微核试验中的骨髓。

注释13：已有文献报道关于体内和体外试验结果之间差异的问题，差异包括：（a）体外形成的代谢产物未必在体内形成；（b）活

性代谢产物可能在体内迅速被解毒而体外则不能；（c）受试物在体内可迅速、有效地被排泄等。

注释14：虽骨髓或外周血以外组织进行的体内试验可提供有用的信息，但是至今仍无一种已经验证并广泛应用的检测基因突变的体内试验方法。一些用大鼠或小鼠某些组织中的内源性基因或转基因的体内基因突变方法还处于研究阶段。在这类方法得到公认之前，采用骨髓以外的组织检测遗传毒性的体内试验方法可进一步提供一些有价值的数据，但应对选用该方法的合理性进行科学验证。如对于体内肝程序外DNA合成（UDS）试验，对文献的回顾表明，将肝UDS试验和骨髓微核试验二种方法组合，可检测出大多数遗传毒性致癌剂，且假阳性率较低。但是，某些不稳定的遗传毒性化合物和某些芳香胺，用该组合试验检测虽然也得到阴性结果，但是，在很多体内试验方法却证明这些化合物是有问题的，因此，进一步的体内试验结果不应仅局限于肝UDS试验，其他方法如32P后标记、DNA链断裂试验等也应予以考虑。

注释15：对众多药物进行二室间药物水平的直接比较的研究表明，骨髓是血液灌流性良好的组织，故血液或血浆中药物相关物质的水平与骨髓中水平相似。虽然药物浓度不总是完全一致，但是检测血液或血浆中药物浓度与确定骨髓中暴露水平有足够的相关性。

注释16：在某些情况下，在对所有现有资料进行评估后，证据权衡提示无遗传毒性危害。例如，在体外细胞遗传学试验的一种暴露方案下出现了阳性反应，该阳性结果仅在高剂量时出现，而发生率升高的程度在所用溶剂和细胞系的历史对照数据范围内或刚刚超出该范围。证据权衡后可能提示，虽然染色体异常频率的轻微升高有统计学意义，但无生物学相关性。有帮助的考虑因素包括（1）在出现阳

性结果的剂量时细胞毒性的水平；（2）相同试验或补充试验的确证性数据。例如，在无代谢活化下短期暴露时出现阳性结果，但在相当细胞毒性水平的长期暴露中未得到确证，这时阳性结果可能不具有生物学意义。与之类似，在体外染色体畸变试验得到阳性结果，而在相当暴露方案下小鼠淋巴瘤试验未得到确证，也可对该阳性结果的意义产生疑问。如果证据权衡法提示无遗传毒性危害，可进行重复给药的临床试验，该阳性结果应写入研究者手册和知情同意书中。

注释17：一些情况下，体外遗传毒性试验显示出可重复性的阳性结果，而体内骨髓细胞遗传学试验结果经常为阴性，这种差异可能来源于体内外试验生物系统、代谢途径、药物浓度等差异。这种情况下，为确证体外试验阳性结果，进行附加的体内试验很有价值。例如，小鼠重复给药毒性试验中进行外周血涂片可用来评估诱导微核的作用，大鼠或猴重复给药毒性试验进行外周血淋巴细胞培养可用于评估细胞分裂中期的染色体损伤。在潜在的靶组织中应评估DNA损伤（如通过彗星或碱基洗脱试验来评估DNA加合物或DNA链断裂），或用转基因大鼠或小鼠来评估在可能的靶组织中的诱变性。当体外遗传毒性试验结果为阳性时，叙利亚仓鼠胚胎细胞（SHE）转化试验可用作附加试验。一些转基因小鼠也可以在短期致癌性试验中应用，如研究显示p53单一缺陷小鼠可用于致突变性致癌剂的鉴定。

九、附录

推荐的标准试验组合中的遗传毒性试验方法

注：以下方法中所提供的最高浓度和最高剂量设计原则主要针对化学药物，中药、天然药物由于情况复杂，应综合考虑多方面因素，不能简单套用该原则，试验时应根据具体情况进行合理的设计。

（一）细菌回复突变试验（Bacterial reverse mutation test）

1、菌株

组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和/或色氨酸营养缺陷型埃希氏大肠杆菌，至少应包含下述五种菌株组合（除特殊说明外，均为鼠伤寒沙门氏菌）：

（1）TA98；（2）TA100；（3）TA1535；（4）TA1537或TA97或TA97a；（5）TA102或大肠埃希杆菌WP2 uvrA或大肠埃希杆菌WP2 uvrA（pKM101）。

菌株特性鉴定需符合要求，-80℃或液氮冻存备用。

2、浓度

至少应包含5个可用于结果分析的浓度。

最高浓度主要取决于受试物对细菌的毒性和/或溶解度：

a、对于可溶性的无毒受试物，推荐的最高测试浓度一般为5mg/皿； b、对于可溶性的有细菌毒性的受试物，应根据杀菌或抑菌情况确定最高浓度（详见正文1.2.2）；

c、对于难溶性的受试物，一般采用最小沉淀浓度为最高浓度；若观察到浓度相关性的细胞毒性或诱变性，则要求检测多个产生沉淀的浓度（详见正文1.2.3）。

3、代谢活化

一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在S9混合液中的浓度一般为5～30％（v/v）。

4、对照

代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照

和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的菌株特异性的阳性致突变剂。

5、方法

可采用标准平板掺入法或预培养法，受试物处理后48～72小时观察结果。每一浓度至少平行三皿。实验至少重复一次。

6、结果判定

结果中应描述各浓度组细菌毒性大小和沉淀情况，结果表示为每皿的回复突变菌落数，并计算各组的均值和标准差。

至少在一个菌株上，在有或无代谢活化的情况下，受试物所诱发的回复突变菌落数出现浓度依赖性的增加和/或在一个或多个浓度组上出现可重复性的增加，可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学方法有助于对结果的评价，但是统计学意义不是阳性反应的唯一标准。

（二）体外哺乳动物细胞染色体畸变试验（In vitro Mammalian chromosomal aberration test）

1、细胞

可采用哺乳动物或人的细胞进行试验，如CHL细胞、CHO细胞、人外周血淋巴细胞等，细胞系需定期检查核型和有无支原体污染等。-80℃或液氮冻存备用。

2、浓度

至少应包含3个可用于结果分析的浓度。

最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度，中、低浓度一般采用倍比稀释法：

a、对于可溶性的无毒受试物，推荐的最高测试浓度一般为5mg/ml或10mM（选用较低者）；

b、对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性大小确定最高浓度，如通过活细胞计数、细胞融合率或有丝分裂指数等确定，一般毒性应大于50％（详见正文1.2.2）；

c、对于难溶性的受试物，一般采用最小沉淀浓度为最高浓度；若观察到浓度相关性的细胞毒性或诱变性，则要求检测多个产生沉淀的浓度（详见正文1.2.3）。

3、代谢活化

一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在试验介质中的终浓度一般为1～10％（v/v）。

4、对照

代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性致突变剂。

5、方法

处理及细胞收获时间：在代谢或非代谢活化的情况下，受试物和细胞作用3～6小时，在1.5个细胞周期时收获细胞。若均得到阴性结果，需在非代谢活化条件下，受试物和细胞应持续作用至1.5个细胞周期时收获细胞。对某些受试物与细胞接触时间/收获细胞时间可能要大于1.5个细胞周期。

读片分析：一般油镜下每种浓度至少观察200个分散良好的中期分裂相细胞，若观察到大量染色体畸变细胞，分析细胞数可相应减少。应分别记录各组含有结构畸变染色体的细胞数和畸变类型，裂隙应单独记录，但不计入畸变率中。同时应单独记录多倍体和内

复制等数目畸变，但不计入畸变率中。

6、结果判定

结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况，结果表示为染色体结构畸变细胞的百分率。

受试物所诱发的染色体畸变率出现浓度依赖性的增加，或出现可重复性的增加，可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学方法有助于对结果的评价，但是统计学意义不是阳性反应的唯一标准。

多倍体数目的增加提示受试物可能会抑制有丝分裂或诱导染色体数目畸变。出现染色体内复制的细胞数增多提示受试物可能会影响细胞周期。

（三）小鼠淋巴瘤细胞试验（Mouse lymphoma assay，MLA）

1、细胞

通常采用小鼠淋巴瘤L5178Y tk+/- 3.7.2 C细胞，需定期检查核型或有无支原体污染等，必要时进行自发突变细胞的清除。-80℃或液氮冻存备用。

2、浓度

至少应包含4（平行处理）～8（单处理）个可用于结果分析的浓度。

最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度，中、低浓度一般采用倍比稀释法：

a、对于可溶性的无毒受试物，推荐的最高测试浓度一般为5mg/ml或10mM（选用较低者）；

b、对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性大小确定最高浓度，如通过评价平板接种效率或相对总生长率确定细胞毒

性，最高浓度应能产生至少80%毒性（即存活率不大于20%）。对于细胞存活率低于10%的阳性结果，应谨慎对待（详见正文1.2.2）。

c、对于难溶性的受试物，一般采用最小沉淀浓度最为最高浓度；若观察到浓度相关性的细胞毒性或诱变性，则要求检测多个产生沉淀的浓（详见正文1.2.3）。

3、代谢活化

一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在试验介质中的终浓度一般为1～10％（v/v）。

4、对照

代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性致突变剂。

5、方法

一般采用微孔法进行试验。

药物处理时间：在代谢活化或非代谢活化条件下，一般受试物与细胞作用3～4小时。如果受试物作用3～4小时后结果为阴性，还需进行在无代谢活化条件下作用24h的附加试验进一步确定。

突变表达期：受试物与细胞作用3～4小时后，去除受试物，将细胞重悬于培养液中，一般L5178Y细胞的突变表达期为2天，分别在处理结束后及表达期结束后测定平板接种效率以确定细胞毒性。

突变率测定：表达期结束后，将细胞接种于含有突变选择剂三氟胸苷（TFT）的96孔板中进行TFT抗性突变集落的测定。如果受试物出现阳性结果，则至少有一个受试物浓度组（一般为最高浓度）和阴性、阳性对照组需要分别记录含有大、小集落的孔数；如果为阴性结

果，仅阴性和阳性对照组需要分别记录含有大、小集落的孔数。

6、结果判定

结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况，结果表示为各浓度组的突变率。

如果一个或多个浓度组出现浓度依赖性和/或可重复性的突变率增加，则判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学方法有助于对结果的评价，但是统计学意义不是阳性反应的唯一标准。

如果出现明确的阳性结果，则不需要重复试验；如果出现可疑结果则需要重复试验；如果代谢活化条件下为阴性结果，可依据具体问题具体分析的原则考虑是否需要重复试验，若不进行重复试验时需说明理由。在重复试验中，可以考虑改变剂量间距或代谢活化条件。

（四）哺乳动物体内微核试验（Mammalian erythrocyte micronucleus test）

1、动物

骨髓试验通常采用小鼠和大鼠，如合适也可选用其他哺乳动物。检测外周血时推荐采用小鼠。但是如果是脾无法清除带微核的红细胞的种属，或已证明用于检测可引起结构和/或数目的染色体畸变的药物有足够敏度的种属也可使用。

采用健康性成熟动物，建议采用雄性，每组至少6只。若性别间存在明显的毒性或代谢方面的差异，则应采用两种性别的动物，每组雌雄至少各5只。如果受试物专用于一种性别，则通常选用相应性别的动物进行试验。起始试验时，动物体重差异应在各性别平均体重的20％之内。

2、剂量

至少应设臵3个剂量组，根据相关毒性试验或预试验的结果确定高剂量，高剂量应产生一定的毒性症状或骨髓毒性（如嗜多染红细胞在红细胞总数中的比例降低）。对于低毒性化合物，给药时间≤14天的推荐最高剂量为2000mg/kg/d，给药时间>14天的推荐最高剂量为1000mg/kg/d；对于单次给药或一天内多次给药达2000mg/kg/d仍无毒性的化合物，设臵3个剂量组的意义不大。

3、对照

应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性致突变剂。

4、方法

给药方案：根据具体情况选择合适的给药方案，可采用单次给药（或24小时内多次给药）或重复给药。受试物的给药途径应尽可能与临床拟用途径相同，阴性对照物必须与受试物给药途径一致，阳性对照物的给药途径可以不同于受试物。

骨髓采样时间：如果采用单次给药，至少应采样2次，骨髓采样时间应在给药后24～48小时内，外周血采样时间应在给药后36～72小时内。受试物第一个采样点应至少包括3个剂量组，第二个采样点可仅包括高剂量组。

如果采用重复给药，可只采样1次，骨髓采样时间应在末次给药后18～24小时，外周血采样时间应在末次给药后36～48小时。

镜检：每只动物至少计数200（骨髓）或1000（外周血）个红细胞以确定嗜多染红细胞（PCE）和总红细胞（嗜多染红细胞和正染红细胞（NCE））的比例；至少计数2000个嗜多染红细胞以判断嗜多染红细胞的微核率。给药组嗜多染红细胞和总红细胞的比例不

应低于对照组的20％。如果给药时间在4周以上，可以直接计数2000个红细胞中的微核率。

5、结果判定

结果中应描述各剂量组的毒性大小，包括一般症状和PCE/（PCE+NCE）的比例，结果表示为各剂量组的嗜多染细胞微核率（MNPCE）。

受试物所诱发的微核率出现有剂量依赖性的升高，或某一剂量组在某一测试点呈现可重复性的明显升高，可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学方法有助于对结果的评价，但是统计学意义不是阳性反应的唯一标准。

如果出现可疑阳性时需重复试验以确证结果，在重复试验中可考虑改变试验条件。