用一个具体事例说明人类与微生物的关系

1. 用一个具体事例说明人类与微生物的关系，为什么说微生物是人类的敌人，更是我们的朋友？（建议上网将一些具体事例作延伸扩展）

2. 为什么微生物能成为生命科学研究的“明星”?

3. 简述巴斯德和柯赫假的微生物学方面贡献.巴斯德的生源说试验和柯赫假说试验给我们哪些启迪?

4. 试举三个实例来说明，即使不用显微镜也可证明在我们的日常生活和环境中，到处有微生物活动着。

1. 简述干热灭菌、湿热灭菌、过滤除菌、药物灭菌原理和方法

2. 简述超净工作台的工作原理

3. 简述稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线分离法操作方法

4. 为什么稀释摇管法适合培养分离厌氧微生物？试设计一种厌氧微生物分离装置，并简述其原理

5. 简述选择培养基直接分离和富集培养分离微生物的原理和步骤

6. 什么是二元培养物，在微生物的保存上有何意义

7. 简述几种常见菌种保藏方法和原理

科赫假说遵循科学研究的规律及采用正确的方法，可以避免失误。回顾SARS病原体的发现过程，可以明显感受到一个假说———科赫假说的魅力。

这个有关疾病病原因子证明的假说，是100多年前由德国伟大的微生物学家罗伯特·科赫提出的。其基本内容为：(1)一特定微生物与某一特定疾病有关系，可从患病的个体中分离到该种微生物。(2)该微生物可以在实验室中分离，并能得到纯培养。(3)经纯培养注入易感动物后，将引起相应疾病发生。(4)在实验感染的动物体内，可分离出该注入的微生物。科赫藉此证明了结核的病因是结核杆菌。经后来学者们的进一步完善，又增加了一条，即(5)感染动物体内可测出对该病毒的特异免疫反应。除了上述五个条件，还有一个就是(6)必须具有可滤过性。

自从2003年2月SARS在广东暴发流行后，国内就开始了对SARS病原体的寻找研究工作。最初广东曾对41份病人的血样检测发现其中10份有腺病毒抗体，但未分离出任何病毒。后国内某研究机构分离出了衣原体，在电镜下看到了

衣原体样的颗粒。这些发现符合上述假说的前两个条件，后来又发现在SARS病人血清中有对衣原体颗粒的抗体产生。但仍有两个很重要的有关动物实验的条件没有满足，此时即认为SARS的病因是衣原体显然证据不足。

与此同时，在WHO的组织下，由德国病毒学家克劳斯·斯托尔 3月17日组织起十余个国家和地区参与的“全球病毒实验室”，首先在几个独立的实验室里排除了可能引起SARS的众多病原体，包括数十种已知病毒、衣原体和支原体。3月18日，德国和中国香港中文大学的实验室用电子显微镜拍到了一种病毒。5分钟之内，该病毒的照片就通过网站发布出来，以供其他实验室的科学家参考。但香港实验室以及美国疾病防治中心的实验室很快证明，最初的猜测是错误的。香港的实验人员将病人的标本进行病毒培养取得成功，加入处于恢复期的SARS病人血清，发现病毒的增殖受到抑制，提示病人血清中产生了抗这种病毒的抗体。该病毒在电子显微镜下呈冠状病毒样颗粒，疑为冠状病毒。

但已知的人类冠状病毒是极为挑剔的，它只在特定的细胞系培养时才能增殖。3月21日晚上，香港大学的裴伟士向“全球病毒实验室”各成员发了一个电子邮件，宣称从患者组织中分离了一种病毒，经电子显微镜下形态观察表现为冠状病毒。很快这项实验在美国、加拿大等其他成员实验室中重复出来。

至此，SARS病原体的研究亦符合了上述假说的前两个和具有可滤过性三个必要条件，但仍有三个条件没有满足，因此，WHO仍无法最后确定SARS的病原体是否是这种新型冠状病毒。4月16日，荷兰鹿特丹伊拉斯谟医学中心的科学家，使用人类近亲的短尾猴成功进行了最后3项试验。即在同一个或相似的寄主身上诱发这种疾病，再将这种病原体从患病的动物身上分离，监测机体免疫系统的血清学反应。至此，假说所有必要条件全部满足，于是4月17日，WHO宣布，确证全球肆虐的SARS病症的病因为一种新型冠状病毒。

由上述可见，科学研究是一个追求真理的过程，来不得半点马虎，也容不得丝毫浮躁，否则就很容易误入歧途。

最近，英国学者菲利普·莫蒂默将科赫假说进一步延伸，提出了传染性疾病暴发确证的五个基本条件，从而避免将疾病暴发的原因归于错误的病原体，避免将多个病原体引起的疾病暴发归于单一的病原因子，以及避免将并非是传染性的疾病暴发错误的认为是传染性的病因所致。这些条件是(1)暴发具有可识别的时

间、地点和情节。(2)有一个共同的传播模式，通常有一个共同的传染源。(3)暴发中的受染者只存在于接触者中，非接触者没有。(4)有证据证明有一个单一的微生物株。(5)当所涉及的微生物的源头得到控制或清除后，暴发减弱并消失。

自由说与生源说的论战微生物的发现大大激发了人们探索生命起源问题的兴趣，也引起了一系列的推测和争论。一碗美味的肉汤一夜之间变得臭味难闻，并能发现其中生活有细菌，虽然人们已不相信上帝创造人，可是汤中的细菌是怎样形成的呢？十七世纪，对这个问题的解释主要有两种观点：一种以为来源于微生物种子，微生物种子从空气中落到食品上，溶液中，从而长出微生物，这就是微生物的生源说；另一种观点以为微生物来自食品和溶液中的非生命物质，是自然发生的，这便是关于微生物起源的自然发生说。两种学说从产生之日起，便展开了旷持日久的激烈论战。

1749年尼得海姆（1713—1781）用热火灰加热肉汁作实验，经过一段时间后他在肉汁中发现了微生物，而这种微生物在实验开始并不存在于肉汁中，于是他得出了细菌起源于肉汁的结论。

约在同一时期，意大利神父——生源说的斗士斯巴兰查理（1729—1799）把牛肉汁煮沸一小时，倒入干净的玻璃瓶子中，盖上盖，瓶中却没有微生物。他立刻找自生说学派论战，却没有说服尼得海姆，尼氏固执地认为空气是微生物自然发生的根本，把瓶子封起来，便把它们和外界空气隔绝了。

大约70年后，舒尔茨（1815—1873）把外界空气通过强酸溶液后再进入煮沸后冷却的肉汁里，施万（1810—1882）则让外界空气经过红热的管道后再进入瓶中的肉汁中，两种情况下肉汁中都没有发现微生物。说明酸和热破坏了空气中的微生物种子。但是，顽固的自生论者认为：酸和热使空气发生了变化而失去“活力”，所以不再滋生微生物。

1850年施洛德和杜奇做了一个更有说服力的实验，让空气经过棉塞后进入密封的冷却肉汁中，肉汁中没有微生物生长。棉塞滤除了空气中的微生物种子。

1859年，自生说被保切特复活。他进行了许多逻辑推理和数据说证，发表了一个“证明”生物自然发生的详细报告。同时代的微生物学家巴斯德被这些推理和数据激怒。他设计了一个鹅颈瓶，现称巴斯德烧瓶，瓶上有一个弯曲的细长管，

与外界空气直接相通。瓶内的溶液加热到沸点，冷却后，空气可以重新进入。由于有弯曲的长管，空气中的尘埃和微生物落在管中而不进入溶液，使溶液保持无微生物生长的状态。如果瓶颈破裂，溶液中就会出现大量微生物。

1864年 4月 17日，巴斯德在巴黎神学院报告了他的实验结果。历经一个多世纪的关于微生物如何产生的激烈争论，以自然发生说的失败而告终。否定微生物的自然发生说是巴斯德对微生物学发展所作的重要贡献之一。

巴斯德的天才实验，得出令人信服的结论，腐败物品上的微生物，来自于空气中的种子。这个实验也导致巴斯德创造了有效的灭菌方法——巴斯德消毒法，并引入到微生物的研究中，推动了基础微生物学的发展。

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生物起源“自生说”的错谬

19世纪60年代，生物学领域展开了一场激烈的争论，争论的主题是：生物能否在很短的时间内从无生命物质中突然地自然发生。争论的一方是以法国生物学家普谢（F·A·Pouchet，1800-1872）为代表，他们提出：生物能够在短时间内从有机物质产生出来。这就是关于生物起源的“自生说”。普谢等人通过实验来说明“自生说”的正确性：他们用显微镜观察腐败的肉汤，发现在短时间内有大量的微生物产生出来，并不需要从空气中进入微生物的胚胎。由此，普谢等人认为“自生说”得到了验证。

可是，法国生物学家巴斯德（L·Pasteur，1822—1895），是个坚定的基督徒，他不相信从无生命的物质当中能产生有生命的微生物。他坚决反对“自生说”。对于普谢等人的实验，巴斯德认为那是空气中的微生物胚胎进入了有机物质中（肉汤）进行大量繁殖结果。为了证明这一点，巴斯德做了两个著名的实验。

1864年，巴斯德把煮沸的肉汤装进60个瓶子里，封上瓶口，把瓶子带到阿尔卑斯山下。在山脚下，打开20个瓶口，让空气进入瓶子，再封上。到了半山腰，又打开了20个瓶子，装进空气，又封上。到了山顶上，又打开最后的20个瓶子，装进空气，又封上。返回巴黎后，巴斯德向生物界同行公开了自己的实验结果：山底下的20个瓶子中，肉汤全腐败了；半山腰的20个瓶子中，只有5

瓶发生了腐败；山顶上的20个瓶子中，只有一瓶发生了轻微的腐败。这是因为山底下的空气中所含微生物多，而越往高处走，空气比较干净，微生物就较少，所以三个高度不同的瓶子中的肉汤，腐败的程度不一样。这说明普谢等人的实验没有考虑的空气中微生物的存在。

为了进一步证实自己的观点，巴斯德又在众人面前从头到尾又作了一个实验——“曲颈烧瓶实验”。他把煮沸的肉汤装进各种弯度的S形颈瓶，空气可以通过颈口自由进入瓶子内。过了一段时间，大家观察到：瓶颈弯度小的瓶子，肉汤腐败严重；瓶颈弯度大的瓶子，肉汤腐败轻微。这表明，瓶颈弯度小的，空气中的微生物进入瓶中多；弯度大的，空气中的微生物大都沾留在弯管的内壁上，很难进入瓶内，因而肉汤腐败较轻。

通过大量的富有成效的实验，和许多言辞尖刻锋利的论战，巴斯德有效地摧毁了、否定了“生物能从无生命的物质中产生出来”的“生物自然发生学说（即自生说）”理论。然而这种学说作为一种时髦的东西，曾经占领过统治地位。因此，普谢起来向巴斯德挑战。两大著名生物学家要“摆擂比武”，这件事可非同小可。为了表示重视，法国科学院特意指派了一个委员会来解决这场争论。1864年6月22日，在皇家植物园自然博物馆切维尔实验室里，一场巴斯德与普谢的最后的较量即将开始。巴斯德作了大量的准备，提前预备好了由委员会指定的60种实验所需要的“浸出液”；但是，普谢却拒绝进行相似的实验，自动退出了论战。所以，巴斯德因普谢的缺席弃权而被委员会宣布获胜。

巴斯德和巴氏灭菌法

由来

巴氏灭菌法（法语：Pasteurisation）的产生来源于巴斯德解决啤酒变酸的问题。当时，法国酿酒业面临着一个令人头疼的问题，那就是啤酒在酿出后会变酸，根本无法饮用。而且这种变酸现象还时常发生。巴斯德受人邀请去研究这个问题。经过长时间的观察，他发现使啤酒变酸的罪魁祸首是乳酸杆菌。营养丰富的啤酒简直就是乳酸杆菌生长的天堂。采取简单的煮沸的方法是可以杀死乳酸杆菌的，

但是，这样一来啤酒也就被煮坏了。巴斯德尝试使用不同的温度来杀死乳酸杆菌，而又不会破坏啤酒本身。最后，巴斯德的研究结果是：以50~ 60℃的温度加热啤酒半小时，就可以杀死啤酒里的乳酸杆菌，而不必煮沸。这一方法挽救了法国的酿酒业。这种灭菌法也就被称为“巴氏灭菌法”。在我们生活中有着广泛应用，如酸奶大多数都是巴氏杀菌法制成的。

主要原理

在一定温度范围内，温度越低，细菌繁殖越慢；温度越高，繁殖越快（一般微生物生长的适宜温度为28℃— 37℃）。但温度太高，细菌就会死亡。不同的细菌有不同的最适生长温度和耐热、耐冷能力。巴氏消毒其实就是利用病原体不是很耐热的特点，用适当的温度和保温时间处理，将其全部杀灭。但经巴氏消毒后，仍保留了小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢，因此巴氏消毒牛奶要在4℃左右的温度下保存，且只能保存3~10天，最多16天。

现行方法

当今使用的巴氏杀菌程序种类繁多。“低温长时间”(LTLT)处理是一个间歇过程，如今只被小型乳品厂用来生产一些奶酪制品。“高温短时间”(HTST)处理是一个“流动”过程，通常在板式热交换器中进行，如今被广泛应用于饮用牛奶的生产。通过该方式获得的产品不是无菌的，即仍含有微生物，且在储存和处理的过程中需要冷藏。“快速巴氏杀菌”主要应用于生产酸奶乳制品。目前国际上通用的巴氏高温消毒法主要有两种：

一种是将牛奶加热到62~ 65℃，保持30分钟。采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%~99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌多数是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。

第二种方法将牛奶加热到75~ 90℃，保温15~16秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。但杀菌的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。

PU,在60℃温度下保温一分钟即称为灭菌强度是一个PU.

主要为牛奶的一种灭菌法，既可杀死对健康有害的病原菌又可使乳质尽量少

发生变化。也就是根据对耐高温性极强的结核菌热致死曲线和乳质中最易受热影响的奶油分离性热破坏曲线的差异原理，在低温下长时间或高温下短时间进行加热处理的一种方法。其中，在60℃以下加热30分钟的方式，作为低温灭菌的标准，早为世界广泛采用。利用高温处理，虽对乳质多少有些影响，但可增强灭菌效果，这种方法称为高温灭菌（sterilization），也就是在95℃以上加热20秒。巴氏灭菌法除牛奶之外，也可应用于发酵产品。

巴氏灭菌机

通常，市场上出售的袋装牛奶就是采用巴氏灭菌法生产的。工厂采来鲜牛奶，先进行低温处理，然后用巴氏消毒法进行灭菌。用这种方法生产的袋装牛奶通常可以保存较长时间。当然，具体的处理过程和工艺要复杂的多，不过总体原则就是这样。

需要指出的是，喝新鲜牛奶（指刚刚挤出的牛奶）反而是不安全的，因为它可能包含对我们身体有害的细菌。另一点是，巴氏消毒法也不是万能的，经过巴氏消毒法处理的牛奶仍然要储存在较低的温度下（一般

巴氏消毒牛奶是世界上消耗最多的牛奶品种，英国、澳大利亚、美国、加拿大等国家巴氏消毒奶的消耗量都占液态奶80%以上，品种有全脱脂、半脱脂或全脂的。在美国市场上，实际几乎全是巴氏消毒奶，而且是大包装（1升、 2升、1加仑）的，市民上超市一次就买够一个星期喝的鲜奶。市场很少有灭菌纯牛奶卖，有的小城镇根本买不到。

巴氏消毒纯鲜奶较好地保存了牛奶的营养与天然风味，在所有牛奶品种中是最好的一种。其实，只要巴氏消毒奶在 4℃左右的温度下保存，细菌的繁殖就非常慢，牛奶的营养和风味就可在几天内保持不变。

替代方法

超高温灭菌法

随着技术的进步，人们还使用超高温灭菌法（UHT超高温瞬间灭菌，高于100℃，但是加热时间很短，对营养成分破坏小）对牛奶进行处理。经过这样处

理的牛奶的保质期会更长。我们看到的那种纸盒包装的牛奶大多数是采用这种方法。

脉冲电场杀菌贮藏技术

在液体介质中利用脉冲放电的生物效应杀菌，杀菌设备一般由供给能量的脉冲放电电源和液体物料直接杀菌的杀菌室两大部分构成，工作原理：脉冲放电杀菌时，把液态物料作为电介质置于杀菌室两电极间隙内或连续流过杀菌室的两电极间隙，当两电极加上一定强度和频率的脉冲电场时，在液态物料中产生极强烈的生物效应杀死其中的细菌。

电解杀菌技术

在导电的溶液中，由于在电极和溶液界面上交换电子而引起的氧化还原反应，这种技术的反应分2种，一种是在外界电能的作用下发生的，一种是没有外接电源而是靠外界的光能、热能或者其他形式的能量激发而成。

交流电杀菌技术

一般是指果蔬汁类的液体物料内通过数百赫兹以下的低频交流电杀死微生物细菌的方法，其中有一种扩展使用方法，利用交流电的热效应，也称之为电阻加热技术，它是利用连续流动的导电液体的电阻热效应来进行加热，以达到杀菌目的。

超声波杀菌技术

利用超声波在固体、液体、和气体中传播时的空化效应、力学效应、化学效应、热效应、弥散效应、声流效应、毛细效应、触变效应的一系列反应来达到杀菌目的。

激光杀菌技术

激光是一种电磁波，也是一种能量流(光子流)，利用当它作用在生物体产生的一些特殊生物效应(化学反应、热效应、电子效应、压力效应、生物刺激效应)的工作原理杀菌。

脉冲强光杀菌技术

利用强烈白光闪照的技术进行杀菌，该技术一般用于处理食品的表面杀菌，可以延长透明物料的预包装食品的货架期。

磁场杀菌技术

无论是恒定磁场还是脉冲磁场都能有效地抑制某些微生物和细菌的生长，当达到一定的磁场强度时利用通过抑制食品的自由基活动、影响蛋白质和酶的活性使酶、氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子失去活性，杀死细菌。

路易斯·巴斯德

路易斯·巴斯德（Louis Pasteur） (1821-1895.9.25) 法国微生物学家、化学家，近代微生物学的奠基人。像牛顿开辟出经典力学一样，巴斯德开辟了微生物领域，创立了一整套独特的微生物学基本研究方法，开始用“实践-理论-实践”的方法开始研究，他也是一位科学巨人。

巴斯德的成就

巴斯德一生进行了多项探索性的研究，取得了重大成果，是19世纪最有成就的科学家之一。他用一生的精力证明了三个科学问题：（1）每一种发酵作用都是由于一种微菌的发展，这位法国化学家发现用加热的方法可以杀灭那些让啤酒变苦的恼人的微生物。很快，“巴氏杀菌法”便应用在各种食物和饮料上。（2）每一种传染病都是一种微菌在生物体内的发展：由于发现并根除了一种侵害蚕卵的细菌，巴斯德拯救了法国的丝绸工业。（3）传染病的微菌，在特殊的培养之下可以减轻毒力，使他们从病菌变成防病的疫苗。他意识到许多疾病均由微生物引起，于是建立起了细菌理论。（4）曲颈瓶的巧妙发明和细菌试验证明其不是由腐败的物体产生，而是细菌将物体腐化，打破了牛顿等人长久以来的观点。

路易斯·巴斯德被世人称颂为 “进入科学王国的最完美无缺的人”，他不仅是个理论上的天才，还是个善于解决实际问题的人。他于1843年发表的两篇论文——“双晶现象研究”和“结晶形态”，开创了对物质光学性质的研究。1856年至1860年，他提出了以微生物代谢活动为基础的发酵本质新理论，1857年发表的

“关于乳酸发酵的记录”是微生物学界公认的经典论文。1880年后又成功地研制出鸡霍乱疫苗、狂犬病疫苗等多种疫苗，其理论和免疫法引起了医学实践的重大变革。此外，巴斯德的工作还成功地挽救了法国处于困境中的酿酒业、养蚕业和畜牧业。

巴斯德与医学

巴斯德被认为是医学史上最重要的杰出人物。巴斯德的贡献涉及到几个学科，但他的声誉则集中在保卫、支持病菌论及发展疫苗接种以防疾病方面。

巴斯德并不是病菌的最早发现者。在他之前已有基鲁拉、包亨利等人提出过类似的假想。但是，巴斯德不仅热情勇敢地提出关于病菌的理论，而且通过大量实验，证明了他的理论的正确性，令科学界信服，这是他的主要贡献。

显然病因在于细菌，那么显而易见，只有防止细菌进入人体才能避免得病。因此，巴斯德强调医生要使用消毒法。向世界提出在手术中使用消毒法的约瑟夫·辛斯特便是受了巴斯德的影响。有毒细菌是通过食物、饮料进入人体的。巴斯德发展了在饮料中杀菌的方法，后称之为巴氏消毒法（加热灭菌）。

传染病

巴斯特50岁时将注意力集中到恶性痈痕上。那是一种危害牲畜及其他动物，包括人在内的传染病；巴斯德证明其病因在于一种特殊细菌。他使用减毒的恶性痈疽杆状菌为牲口注射。

1881年，巴斯德改进了减轻病原微生物毒力的方法，他观察到患过某种传染病并得到痊愈的动物，以后对该病有免疫力。据此用减毒的炭疽、鸡霍乱病原菌分别免疫绵羊和鸡，获得成功。这个方法大大激发了科学家的热情。人们从此知道利用这种方法可以免除许多传染病。

狂犬病

1882年，巴斯德被选为法兰西学院院士，同年开始研究狂犬病，证明病原体存在于患兽唾液及神经系统中，并制成病毒活疫苗，成功地帮助人获得了该病的免疫力。按照巴斯德免疫法，医学科学家们创造了防止若干种危险病的疫苗，成功地免除了斑疹伤寒，小儿麻痹等疾病的威胁。

说到狂犬病，人们自然会想到巴斯德那段脍炙人口的故事。在细菌学说占统治地位的年代，巴斯德并不知道狂犬病是一种病毒病，但从科学实践中他知道有侵染性的物质经过反复传代和干燥，会减少其毒性。他将含有病原的狂犬病的延髓提取液多次注射兔子后，再将这些减毒的液体注射狗，以后狗就能抵抗正常强度的狂犬病毒的侵染。1885年人们把一个被疯狗咬得很厉害的9岁男孩送到巴斯德那里请求抢救，巴斯德犹豫了一会后，就给这个孩子注射了毒性减到很低的上述提取液，然后再逐渐用毒性较强的提取液注射。巴斯德的想法是希望在狂犬病的潜伏期过去之前，使他产生抵抗力。结果巴斯德成功了，孩子得救了。在1886年还救活了另一位在抢救被疯狗袭击的同伴时被严重咬伤的15岁牧童朱皮叶，现在记述着少年的见义勇为和巴斯德丰功伟绩的雕塑就坐落的巴黎巴斯德研究所外。巴斯德在1889年发明了狂犬病疫苗，他还指出这种病原物是某种可以通过细菌滤器的“过滤性的超微生物”。

预防接种技术

巴斯德本人最为著名的成就是发展了一项对人类进行预防接种的技术。这项技术可使人类抵御可怕的狂犬病。其他科学家应用巴斯德的基本思想先后发展出抵御许多种严重疾病的疫苗，如预防斑疹伤寒和脊髓灰质炎等疾病。

正是他做了比别人多得多的实验，令人信服地说明了微生物世界的产生过程。巴斯德还发现了厌氧生活现象，也就是说某些微生物可以在缺少空气或氧气的环境中生存。巴斯德对蚕病的研究具有极大的经济价值。他还发展了一种用于抵御鸡霍乱的疫苗。

人们以常将巴斯德同英国医生爱德华·琴纳比较。琴纳发展了一种抵御天花的疫苗，而巴斯德的方法已经应用于防治很多种疾病。

发酵

1854年9月，法国教育部委任巴斯德为里尔工学院院长兼化学系主任，这时的他对酒精工业发生了兴趣，而制作酒精的一道重要工序就是发酵。当时里尔一家酒精制造工厂遇到技术问题，请求巴斯德帮助研究发酵过程，巴斯德深入工厂考察，把各种甜菜根汁和发酵中的液体带回实验室观察。经过多次实验，他发现，发酵液里有一种比酵母菌小得多的球状小体，它长大后就是酵母菌。

不久，在菌体上长出芽体，芽体长大后脱落，又成为新的球状小体，在这循环不断的过程中，甜菜根汁就“发酵”了。巴斯德继续研究，弄清发酵时所产生的酒精和二氧化碳气体都是酵母使糖分解得来的。这个过程即使在没有氧的条件下也能发生，他认为发酵就是酵母的无氧呼吸并控制它们的生活条件，这是酿酒的关键环节。

1857年路易斯·巴斯德年发表的“关于乳酸发酵的记录”是微生物学界公认的经典论文。

1880年路易斯·巴斯德成功地研制出鸡霍乱疫苗、狂犬病疫苗等多种疫苗，其理论和免疫法引起了医学实践的重大变革。

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1)巴斯德

巴斯德原是化学家，曾在化学上作出过重要的贡献，后来转向微生物学研究领域，为微生物学的建立和发展作出了卓越的贡献。主要集中在下列三方面。

(1)彻底否定了



 (2)免疫学--预防接种

 Jenner虽然早在1798年发明了种痘法可预防天花，但却不了解这个免疫过程的基本机制，因此，这个发现没能获得继续发展。1877年，巴斯德研究了鸡霍乱，发现将病原菌减毒可诱发免疫性，以预防鸡霍乱病。其后他又研究了牛、羊炭疽病和狂犬病，并首次制成狂犬疫苗，证实其免疫学说，为人类防病、治病作出了重大贡献。

 (3)证实发酵是由微生物引起的

酒精发酵是一个由微生物引起的生物过程还是一个纯粹的化学反应过程，曾是化学家和微生物学家激烈争论的问题。巴斯德在否定

 (4)其他贡献

 一直沿用至今天的巴斯德消毒法(60～65℃）作短时间加热处理，杀死有害微生物的一种消毒法)和家蚕软化病问题的解决也是巴斯德的重要贡献，他不仅在实践上解决了当时法国酒变质和家蚕软化病的实际问题，而且也推动了微生物病原学说发展，并深刻影响医学的发展。

 2).柯赫

柯赫(图1-5)是著名的细菌学家，由于他曾经是一名医生，因此对病原细菌的研究作出了突出的贡

(1)具体证实了炭疽病菌是炭疽病的病原菌。

(2)发现了肺结核病的病原菌，这是当时死亡率极高的传染性疾病，因此柯赫获得了诺贝尔奖。

(3)提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则--柯赫原则。由于柯赫在病原菌研究方面的开创性工作，自19世纪70年代至20世纪20年代成了发现病原菌的黄金时代，所发现的各种病原微生物不下百余种，其中还包括植物病原细菌。

柯赫除了在病原菌研究方面的伟大成就外，在微生物基本操作技术方面的贡献更是为微生物学的发展奠定了技术基础，这些技术包括：

 (1)用固体培养基分离纯化微生物的技术，这是进行微生物学研究的基本前体，这项技术一直沿用至今。

 (2)配制培养基。也是当今微生物学研究的基本技术之一。这二项技术不仅是具有微生物学研究特色的重要技术，而且也为当今动植物细胞的培养作出了十分重要的贡献。

 巴斯德和柯赫的杰出工作，使微生物学作为一门独立的学科开始形成，并出现以他们为代表而建立的各分枝学科，例如细菌学、消毒外科技术，免疫学、土壤微生物学、病毒学、植物病理学和真菌学、酿造学以及化学治疗法等。微生物学的研究内容日趋丰富，使微生物学