可溶性酵母葡聚糖的制备及其活性研究
254中国生化药物杂志ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2010年第31卷第4
期
速为2.5L/min。
阿拉伯胶完全水解后可获得D2半乳糖、L2阿拉伯糖、L2鼠李糖和D2葡萄糖醛酸。实验中使用的色谱柱为氨基柱,与D2葡萄糖醛酸的结合作用较强,在以乙腈2水作流动相时,未被洗脱,因而不出峰;当
1.D2半乳糖;2.L2阿拉伯糖1.D2galactose;2.L2arabinose
图2 HPLC2ELSD法测定阿拉伯胶酶解液的色谱图
Fig.2 HPLCChromatogramofsamplefromarabicgumhydrol2ysatedwithenzyme
改用乙腈为流动相,D2葡萄糖醛酸即可洗脱下来。这并不影响L2阿拉伯糖的检测,对实验结果无影响。
本文建立的HPLC2ELSD法对L2阿拉伯糖的检测较为理想,无须进行衍生化而直接将样品进行分析,方法简便快速、分析的灵敏度高,结果重复性好,可对阿拉伯胶水解过程中拉伯糖的含量进行实时检测,糖。:
[]Kat,etal.ProcessforproducingL2arabinose,L2
arabinose2containingenzymaticallyprocessedprouducts,dietfoods,diabeticdietfoodsandfruitorvegetablejuicesandprocessforproducingthesame:US,6632448[P].2003210214.
[2] 冯亚青,刘燕,张晓东,等.从L2阿拉伯胶提取L2阿拉伯糖[J].
能有效改善色谱峰形,利于各种糖组分的基线分离,
但不利于糖的溶解,分析时间也会显著延长。综合考虑分离效果、分析时间等因素,本实验采取乙腈2水(80∶20)作为流动相。实验中首先保持载气流速为2L/min不变,变漂移管温度(60,70,80,90,100,110),号基线水平和噪音。在100峰形好,度确定为100100℃,,2.5L/min为在较小噪音且是普遍产生较大检测响应值的最低气速。故选定漂移管温度为100℃,氮气流
精细化工,2003,20(5):2882290.
[3] 梁蔚阳,冯炜菁.高效液相色谱—示差折光检测法测定注射用
转化糖中果糖与葡萄糖的含量[J].中国生化药物杂志,2007,
28(2):1162117.
可溶性酵母葡聚糖的制备及其活性研究
余奕珂,白雪芳,杜昱光
(中国科学院大连化学物理研究所,辽宁大连116023)
摘 要:目的改善酵母葡聚糖的溶解性能,探讨增溶后酵母葡聚糖的生物学活性。方法以酵母葡聚糖为原料,经过碱性蛋白酶处理得到水溶性葡聚糖,然后进行抗氧化活性和抑制血管紧张素转换酶I(ACE)活性的研究。结果酵母葡聚糖水解液在邻苯三酚自氧化发光体系中对O2・的清除和对ACE的抑制均成剂量依赖关系,它对O2・的半抑制浓度为0.55mg/mL,对ACE的半抑制浓度为0.16mg/mL。结论酵母葡聚糖经水解增溶后得到的水溶性葡聚糖具有良好的抗氧化活性和ACE抑制活性。 关键词:酵母葡聚糖;水解;抗氧化;ACE抑制活性
中图分类号:TQ929.2;R285 文献标识码:A 文章编号:100521678(2010)0420254204
--
收稿日期:2009208226
基金项目:国家“863”计划,对虾和海参高效免疫增强剂的研制
(2006AA100313)
作者简介:余奕珂(19792),女,博士,研究方向为功能性食品研究,E2mail:[email protected];杜昱光,通信作者,研究员,博士生导师,E2mail:[email protected]。
Studyonpreparationandactivityofsolubleyeastglucan
YUYi2ke,BAIXue2fang,DUYu2guang
(DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China)
Abstract:PurposeToimprovethesolubilityoftheyeastglucanandtoexplorethebiologicalactivi2tiesofthesolubleglucan.MethodsThesolubleglucanwasobtainedthroughhydrolysisoftheyeastglu2canwithalcalase.AntioxdantactivityandangiotensinI2convertingenzyme(ACE)activityofthehydroly2
-・
satewereassayed.ResultsScavengingeffectonsuperoxideanionfreeradical(O2)producedfromtheself2oxidationmethodofPyrogallolandinhibitingeffectonACEexhibitedadose2dependentrelationship,withIC50valuesof0.55and0.16mg/mL,respectively.ConclusionThesolubleglucanhadgoodantioxi2dantandACEinhibitoryactivity.
Keywords:yeastglucan;hydrolysis;antioxidant;ACEinhibitoryactivity
酵母细胞壁由外到内分为3层,分别为甘露糖、蛋白质和葡聚糖。葡聚糖中大部分为β21,32葡聚[1]
糖。有研究表明,β21,32葡聚糖具有抗肿瘤,病毒、细菌、真菌等引起的感染,疫力,预防糖尿病、,
[]
。
β21,32葡聚糖难溶于水,应用受到限制。因此对其进行化学改性或生物降解,改善溶解性,是开发利用酵母葡聚糖的有效途径。国内学者对β21,32葡聚糖的化学改性增溶进行了广泛的研究,如硫酸化、羧甲基化、磷酸化、磺化[3]
等,这些方法可以明显的提高其水溶性,但化学反应剧烈,易造成溶剂残留。而部分来自于芽孢杆菌的Alcalase蛋白酶可以将酵母葡聚糖水解成低聚糖、寡糖,不仅增加了葡聚糖的水溶性,而且避免了使用化学方法带来的污染和安全隐患,更重要的是,葡聚糖在温和的条件下被降解成小分子寡糖,易于体内吸收,更好的发挥生物学功能。
本文利用Alcalase碱性蛋白酶对酵母来源的粗葡聚糖进行水解,对水解产物分别进行了抗氧化活性和血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性的研究,为酵母葡聚糖的开发应用提供依据。1 材 料
粗酵母葡聚糖(纯度83%),平均相对分子质量(Mr)10万～20万,中国海洋大学提供;Alcalase2.4LFG(地衣芽孢杆菌Subtilisin,3.4.21.62,含量10%～15%),丹麦诺维信(NOVO)公司;邻苯三酚,分析纯,天津市光复精细化工研究所;ACE和马尿酰组氨酰亮氨酸(Hip2His2Leu),色谱纯,Sigma公司。
6505紫外-可见分光光度计,美国JENWAY公司;HypersilBDSC18色谱柱(250mm×4.6mm,5
μ、+、P230高压恒流泵、
。21 葡聚糖的水解
葡聚糖2g悬浮于pH8.0的磷酸缓冲液100mL中,60℃,加入Alcalase蛋白酶2mL,反应6h后,在沸水浴中灭活10min,离心,上清液冷冻干燥后备用。2.2 葡聚糖水解液的抗氧化活性
邻苯三酚在弱碱性介质中会自身氧化分解产生--・・
O2,利用O2清除剂能使邻苯三酚自氧化产物在350nm处的吸收峰被抑制这一特点,进行光化学方法测定。
取50mmol/L的Tris2HCl缓冲液(pH8.2)2.98mL,待测样品0.01mL,混匀后在25℃水浴中保温20min,取出后立即加入25℃预热的3mmol/L邻苯三酚溶液0.01mL(以10mmol/LHCl溶液配制,
空白管用10mmol/LHCl溶液代替邻苯三酚溶液)迅速摇匀后倒入比色杯,在350nm波长处每隔30s测定一次吸光度(A)值,计算线性范围内每1minA
[4]
值的增加量。抑制率(%)=(△A02△A)/△A0×100%,△A0为邻苯三酚自氧化速率;△A为加入葡
聚糖水解液后邻苯三酚的自氧化速率。2.3 葡聚糖水解液对ACE的抑制活性
对ACE抑制活性的测定采用优化的Cushman
[5]
和Cheung的方法,用含有608mmol/LNaCl的0.2mol/L硼酸盐缓冲液(pH8.3),将Hip2His2Leu配成7.6mmol/L的溶液。在0.5mL的Eppendof管中分别加入样品5μL和ACE(0.06u/mL)15μL,于37℃下保温5min,加入底物25μL,在37℃下反应30min,最后加入0.1%三氟乙酸(TFA)溶
表2 葡聚糖水解液对ACE的抑制活性
Tab.2 ACEinhibitingactivityofglucanhydrolysate
液终止反应,冷却至室温。采用反相高效液相色谱
(RP2HPLC)测定ACE与底物反应生成马尿酸的量,来判断对ACE的抑制活性。对ACE活性抑制50%时所需要的抑制剂的浓度为IC50。
ACE抑制率(%)=(对照的马尿酸峰面积-样品的马尿酸峰面积)/对照的马尿酸峰面积×100%3 结 果
3.1 葡聚糖水解液对O2的清除
-・
葡聚糖水解液的浓度
/(mg/mL)
010.50.20.10.05马尿酸峰面积
2227.266.555.993.1387.1699.[1**********]6对ACE的抑制率
/%088.0475.0555.3737.7023.70结果见图1和表1。在邻苯三酚自氧化化学发光体系中所选择的不同浓度的葡聚糖水解液均能有效清除O2,随着葡聚糖水解液浓度的增加,O2的自氧化速率逐渐降低,成剂量依赖关系,它对O2的IC50为0.55mg/mL
。
-・
-・
-・
Leu生成具有血管收缩作用的血管紧张素Ⅱ,同时
-◆-.0;-×-.0.125mg/mL;-●-.0.25mg/mL;-▲-.0.5mg/mL;-■-.1mg/mL
图1 不同浓度葡聚糖水解液在邻苯三酚自氧化化学发光体系中对O2・的清除
Fig.1 Scavengingeffectonsuperoxideanionfreeradicalpro2ducedfromtheself2oxidationmethodofpyrogallol
-
表1 葡聚糖水解液对O2・的清除作用
Tab.1 Scavengingeffectonsuperoxideanionfreeradicalwithglucanhydrolysate
-
葡聚糖溶液的浓度
/(mg/mL)010.50.250.125
O2的自氧化速率
-1
0.0119
・
清除率/%
064.7146.2231.0921.01
0.00420.00640.00820.0094
3.2 葡聚糖水解液对ACE的抑制活性
结果见表2。葡聚糖水解液对ACE具有很好的抑制活性,且成剂量依赖关系,它对ACE的IC50为0.16mg/mL。4 讨 论
ACE在人体肾素2血管紧张素系统(Reninan2giotensinsystem,RAS)和激肽释放酶2激肽系统(Kal2likrein2kininsystem,KKS)中,对血压调节起着重要的作用。ACE可以去掉血管紧张素Ⅰ末端的His2
可以使舒缓激肽失活,从而引起血压升高。所以抑
制了ACE,因此研究开发效具有很重要的意[7]义2D2葡聚糖能够有效地清除体内,使这些巨噬细胞继续
[8]
正常发挥其重要的功能。所以近年来许多学者将目光投向葡聚糖的增溶及抗氧化活性和ACE抑制活性的探讨上。
由于酵母细胞壁的组成复杂,含有甘露糖、蛋白质和葡聚糖等成分。本实验选用的Alcalase蛋白酶来自于地衣芽孢杆菌,其中可能混杂了来自同一种属的β2葡聚糖酶,在水解蛋白质成小分子肽的同时,葡聚糖中的糖苷键也被部分水解成寡糖而溶于水。用分子凝胶色谱对酶解液的Mr进行定量发现在Mr1000～2000之间有糖的吸收,它有可能是聚合度不同的葡聚寡糖,这有待于做进一步论证。
本实验对葡聚糖水解液进行了两种生物活性的探讨,发现葡聚糖水解液具有较好的抗氧化活性和
-・
对ACE的抑制活性,它对O2的IC50为0.55mg/mL,对ACE的IC50为0.16mg/mL。抗氧化活性的结果和其他学者研究一致,而对ACE的抑制活性是一个新的发现,这可能是β2葡聚糖表面有负电荷,可以和ACE表面的正电荷结合;β2葡聚糖具有一定的疏水性,可以和ACE的疏水性空腔结合,减少了ACE的活性位点,从而抑制了ACE的活性。至于具体的抑制机理还有待于进一步研究。
综上所述,用食品级的蛋白酶在温和的条件下处理酵母葡聚糖,不仅可以解决葡聚糖难溶于水的问题,降解后得到的寡糖、寡肽人体易于吸收,可以作为功能因子应用于食品中,是一种值得开发研究的食品添加剂。参考文献:
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鸡肠中血管活性肠肽的提取与测定
刘 伟,(山东大学药学院250012)
摘 要:目的。方法分别取新鲜鸡的十二指肠,用水冲洗干净,甩干水分,分别称取20.0g,采用不同方法提取,。结果鸡的十二指肠、空肠和回肠部位血管活性肠肽含量分别为25.53,.热水提取含量较高,在酸性条件下加热容易破坏。结论鸡的全肠均含丰富的血管活性肠肽。
关键词:血管活性肠肽;鸡肠;酶联免疫吸附法
中图分类号:TQ464.5 文献标识码:A 文章编号:100521678(2010)0420257202
Extractionanddeterminationofvasoactiveintestinalpeptideinintestineofchicken
LIUWei,RENHui2xia
(InstituteofBiochemicalandBiotechnologicalDrugs,SchoolofPharmaceuticalScience,
ShandongUniversity,Jinan250012,China)
Abstract:PurposeTodeterminatethevasoactiveintestinalpeptideinintestineofchickenandtocomparetheextractiontechnologies.MethodsDuodenum,jejunum,andileumsegmentoffreshintestineofchickenwerefirstdefatted,andthencleanedwithwater.ELISAmethodwasusedtodetectthecontentofvasoactiveintestinalpeptidesrespectivelyaftertheywereextractedfromtheprocessedintestinalseg2ments(20.0grespectively)bydifferentmethods.ResultsThecontentofvasoactiveintestinalpeptideinduodenum,jejunum,andileumsegmentwas25.53,25.01and23.27ng/grespectively.Thecontentishigherbytheextractioninhotwaterandvasoactiveintestinalpeptideisdestroyedinacidicandhotenvi2ronment.ConclusionVasoactiveintestinalpeptideisrichinintestineofchicken.
Keywords:vasoactiveintestinalpeptide(VIP);chickenintestine;ELISA
鸡肠为雉科动物家鸡(Gallusgallusdomesticus
收稿日期:2009210209
作者简介:刘伟,女,山东泰安人,硕士研究生,主要从事生化药物方面的研究;任慧霞,女,通信作者,副教授,硕士生导师,E2mail:
Brisson)的肠,作为中药治疗遗尿症,我国许多古代
中医药文献均有记载。以鸡肠为主要原料的健
[3]
脾止遗片就是治疗小儿遗尿症的中成药。现代药学研究发现鸡肠提取物可调节兔膀胱逼尿肌和括
[4]
约肌的收缩,并具有神经递质样的生物学功能,
[122]