制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究

生物技术通报

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BIOTECHNOLOGYBULLETIN

2011年第10期

制备高效大肠杆菌电转化感受态

细胞和电转化条件的研究

朱森康

2

1，2

黄磊

2

李燕飞

2，3

钟卫鸿

1

徐志南

2

（1浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州310032；

浙江大学化学工程与生物工程学系，杭州310027；3浙江工业大学药学院，杭州310032）

摘要：旨在建立一种高效大肠杆菌电转化感受态细胞的制备方法，研究了摇瓶装液量，菌体生长阶段，转化电场强

度，转化后复苏时间以及感受态细胞存放时间等对转化效率的影响。结果表明，装液量为400mL/2L，菌体在OD600值为

10

0.452时收集所制备的感受态细胞，在电场强度12.5kV/cm条件下电击5ms，转化后复苏时间2h，转化效率可达到10

CFU/μgDNA。此条件下制备的感受态细胞转化效率高，质量稳定，重复性好。

关键词：

大肠杆菌

电转化

感受态细胞

转化效率

PreparationofEfficientElectrotransformationCompetent

CellsofEscherichiacoliandConditionofElectrotransformation

ZhuSenkang1，2

23

HuangLei2LiYanfei2，3ZhongWeihong1XuZhinan2

（1CollegeofBiologicalandEnvironmentalEngineering，ZhejiangUniversityofTechnology，Hangzhou310032；

DepartmentChemicalandBiologicalEngineering，ZhejiangUniversity，Hangzhou310027；CollegeofPharmaceuticalScience，ZhejiangUniversityofTechnology，Hangzhou310032）

Abstract：TheaimofthisstudywastooptimizethepreparationofE．colielectrotransformationcompetentcells．Inthepresent

theeffectsofdifferentprepareconditionsweresystematicallyinvestigatedtoimprovethetransformationefficiencyofthecompetentwork，

cells．Theoptimalconditionsweredeterminedasfollows：cultivationin400ml/2LLBmedium，collectionofthecellsatOD600ofelectrotransformationat12.5kV/cmfor5ms，posttransformationculturefor2h．Undertheseconditions，thetransformationeffi-0.452，

ciencycouldreach1010CFU/μgDNA．

Keywords：

EscherichiacoliElectrotransformationCompetentcellsTransformationefficiency

感受态细胞的制备和转化是现代分子生物学实

［1］

验中一项重要的常规操作技术，可用于基因克隆以及DNA文库构建等研究。自Cohen首次报道质

E．coli）以粒DNA转化大肠杆菌（Escherichiacoli，

来，转化效率就一直是研究者们所关心的热点问

［2］

Hanahan［3］如氯化钙法、题。目前转化方法很多，

法以及Inoue法。但这些方法转化效率最高达到

106－107CFU/μgDNA，只能满足一般常规克隆的抗体库和突变库等需求。对于涉及构建基因文库、

［4］

研究，这样的转化效率就不能满足试验要求。研究

发现电转化方法是有效提高转化效率的途径之一，

8

然而普通电转化方法的转化效率也只有10－109CFU/μgDNA，本研究对电转化感受态细胞制备

所制备的及电转化条件中几个关键因素进行探索，

10

感受态细胞转化效率可达10CFU/μgDNA。

1材料与方法

E．coliDH5α菌株和质粒

1.1材料

1.1.1菌种和质粒

收稿日期：2011-03-25

基金项目：国家自然科学基金项目（21006088），浙江省自然科学基金项目（Y4100344）

mail：zskchuangqiang@gmail．com作者简介：朱森康，男，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学；E-E-mail：lhuangblue@zju．edu．cn通讯作者：黄磊，男，博士，讲师，

pUC18均为本实验室保存。

1.1.2主要试验仪器及培养基分光光度计Ultro-spec3300pro购自AmershamBiosciences（Sweden）。0.2cm电击杯和genePulserII电脉冲基因转移仪

Rad公司。LB培养基：1%（W/V）蛋白均购自Bio-0.5%（W/V）酵母粉，1%（W/V）氯化钠。胨，

SOC培养基：2%（W/V）蛋白胨，0.5%（W/V）酵0.05%（W/V）氯化钠，0.186g/L氯化钾，母粉，

0.95g/L氯化镁，3.6g/L葡萄糖。甘油为国产分析纯，氨苄青霉素（Amp）购自TaKaRa宝生物公司。1.21.2.1

方法

2.2

感受态细胞的制备从新鲜活化LB平板

37℃，接种于50mLLB培养基中，上挑取单菌落，

图1

E．coliDH5α生长曲线

E．coliDH5α菌株在不同生长阶段的电转化效率

220r/min振荡培养过夜制备种子液。种子液按

1%转接到一定装液量的LB培养基中，37℃，220r/min振荡培养。培养一定时间，测定菌液浓度OD600达到一定值后，取出培养三角瓶，冰浴冷却20min，4℃，5000r/min离心15min，倾去上清液；

4℃，5000r/min将细胞重悬于预冷的去离子水中，

离心10min，重复清洗3次。再将细胞重悬于预冷4℃，8000r/min离心的10%（V/V）甘油溶液中，

10min，重复清洗3次。最后细胞用1/1000初始菌

100μL分液体积的预冷10%（V/V）甘油溶液重悬，装至1.5mL离心管中，保存于－85℃备用。

1.2.2电转化及转化效率的计算取100μL感受态细胞，冰上融化后，迅速加入1ngpUC18质粒，转入预冷的电击杯（间隙0.2cm）中，一定电场强度电

37℃，击后迅速加入900μL37℃SOC培养基，220r/min培养一定时间。以一定倍数稀释后，取

100μL菌液涂布于Amp抗性平板上，37℃恒温培养过夜，菌落计数后按下式计算转化效率。转化效率（CFU/μgDNA）=（每皿转化子平均数×10×菌悬液稀释倍数）/质粒微克数，每一样本同时转化3份。

种子液转接培养后，每一个OD600值时均重复制

不同生长阶段制备的E．备3批电转化感受态细胞，

coliDH5α电转化感受态细胞的转化效率如图2所

示。可见，不同生长阶段所制备的电转化感受态细胞转化效率存在明显差异，在OD600为0.452时出现一个转化效率峰值。有研究表明，对于转化率而言生长不足和生长过度的细菌均只能获得较低的转化

［5］

率，尤其是生长过度的细菌转化率更低。OD600为0.452处于对数生长初期，细胞生长旺盛，且细胞壁结构相对疏松，因此在电击时，更易于孔洞的形成，便于外源DNA的进入，细胞感受能力较强。同时，由于对数初期细胞代谢活跃，在其电击后利于快速恢复。随着培养时间延长，单位体积内细胞数目虽然增加，但细胞感受能力迅速下降，尤其当生长过度后下降更为明显

［5］

。

2

2.1

结果与讨论

E．coliDH5α菌株的生长曲线

E．coliDH5α在LB培养基中的生长曲线如图1

图2

E．coliDH5α在不同生长阶段的电转化效率

7h后进所示，菌体在约1.5h后进入对数生长期，

入稳定期

。

不同装液量制备的电转化感受态转化效率种子液按1%转接到LB培养基中，选取4个不

2.3

DNA通过内膜渗胞质间隙。随后在37℃孵育期间，

透进入细胞浆。在高场强作用下，细胞壁和细胞质膜被瞬间击穿，形成能通过外源物质的跨膜通道。而在低场强作用下，并不能瞬间击穿，需要累积达到一定的电荷强度，才可形成跨膜通道，这样也容易使细胞内容物外流而引起细胞死亡。对于电脉冲时间，太短则不能使DNA分子有效进入细胞，在一定范围内脉冲时间延长，进入感受态细胞质粒DNA越多，转化效率越高。而电脉冲时间过长，电转化效率

［7］

转化效率反而降低。本研究表的提高将被抵消，

明，电击脉冲时间以5ms为好，时间偏离5ms越多

转化效率越低。2.5

转化后复苏时间对电转化效率的影响

在pUC18质粒与感受态细胞混合转入电击杯，

400、同的装液量，即在2L三角瓶中分别装液200、

600以及800mL。试验均重复3次，转化效率如表1所示。

表1

不同装液量下制备的E．coliDH5α电转化效率

装液量（mL）

[1**********]0

转化效率（×109CFU/μgDNA）

5.810.30.80.07

装液量为400mL时，转化效率最高，可达到1010CFU/μg。随着装液量的增加，转化效率明显下当装液量为800mL时，转化效率不到400mL时降，

的1%。三角瓶中菌液在振荡器上振荡，促使空气中的氧有效溶解，因此装液量的多少直接影响溶氧水平，从而影响细胞生长。随着装液量的增加，体积溶氧系数降低，溶氧不能满足细胞生长需求，细胞活性和生长状态受到影响，从而导致制备的感受态细在2L三角瓶中装液量以胞转化效率降低。因此，不超过400mL为宜。2.4

不同电场强度和脉冲时间下的转化效率使用间隙为0.2cm电击杯，分别研究了电压为

电击后加入预热至37℃的SOC培养基，置于37℃，

220r/min分别培养1、1.5、2和2.5h。研究转化后试验均重复3次，结复苏时间对电转化效率的影响，

果如表3所示。复苏2h转化效率最高，可达到1.1×1010CFU/μgDNA。

表3

转化后不同复苏时间E．coliDH5α的转化效率

转化效率（×109CFU/μgDNA）

2.54.51110

转化后复苏时间（h）

11.522.5

1.8kV和2.5kV，即电场强度分别为9kV/cm和

12.5kV/cm时的转化效率，试验重复3次。如表2所示，转化效率在电场强度为12.5kV/cm时是9kV/cm时的将近2倍。

表2

不同电场强度下的E．coliDH5α电转化效率

转化效率（×109CFU/μgDNA）

713

电击作用后应该立即加入复苏培养基以使受损伤的细胞恢复正常生长，复苏2h的转化效率是1h的4倍多。经2h复苏培养可以使细胞恢复电穿孔伤害、进行细胞分裂或发生内部重组，进而增加筛选2h的复苏培养对这些基出单菌落的数量。另外，

因在受体菌中的稳定表达是有益的，因此在复苏培养基中不要添加任何抗生素，否则会大大影响转化子的生长。而复苏时间为2.5h的转化效率与2h相当，因此选择2h为较优的复苏时间。

2.6感受态细胞存放时间对电转化效率的影响

感受态细胞制备后通常并不立即用于转化，试验比较了感受态细胞存放时间对电转化效率的影响，每个不同存放时间均重复3次，结果如图3所示。

电场强度（kV/cm）

912.5

电场强度对转化效率的影响机制较为复杂，电

转化是利用瞬间高压电击细胞的细胞膜，形成孔洞，使外源DNA分子进入细胞内。Kimoto

［6］

的研究表

DNA和细胞是随机分布于电极之间。明，电击前，

DNA和细胞被定向并向阳极运动。电电脉冲早期，

DNA插入细胞的外膜或者进一步进入细脉冲后期，

效率有所增加，保存3d后，效率则持续下降。期，

本研究对高转化效率E．coliDH5α电转化感受态细胞的制备及电转化条件进行了探索。结果表

不同装液量、菌体生长阶段和转化电场强度，转明，

化后复苏时间以及感受态细胞存放时间对转化效率均有明显影响。在优化条件下，所制备的感受态细

10

胞转化效率高达10CFU/μg，为相关的基因工程实验打下了良好的基础。

参考文献

图3

感受态细胞存放时间对转化效率的影响

［1］萨姆布鲁克J，．北京：科学拉塞尔DW．分子克隆实验指南［M］

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2009（增刊）：297-298．细胞的实用操作技巧．生物技术通报，

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［8］DagertM，EhrlichSD．Prolongedincubationincalciumchlorideim-provesthecompetenceofEscherichiacolicells．Gene，1979，6（1）：23-28．

［9］柯涛，张勇法，潘园园．温度对大肠杆菌感受态细胞的影响．河南

2003，37（1）：57-60．农业大学学报，

从结果可见，制备的感受态细胞立即使用时转

－85℃存放3d后，化效率并非最高，转化效率是刚

［8］

制备的近2倍。有研究认为，相对于转化的限制因子，感受态形成因子更加耐受低温，而在低温下限

制因子迅速失活，将导致转化效率提高。从第3天开始，转化效率则开始下降，在保存30d后，转化

随着保存时间效率已下降至与刚制备时相差无几，

继续延长，细胞会衰老或凋亡，影响细胞活性与自主

修复过程，导致转化效率持续下降。

［9］

3结论

大肠杆菌的生长包括4个阶段：停滞期、对数生长期、稳定期以及衰亡期。从生长曲线和不同生长阶段研究可知，大肠杆菌在约1.5h后进入生长对数并在OD600为0.452时，即对数生长初期时获得最期，

高转化效率。另外，研究结果表明，装液量为400mL/2L、电场强度为12.5kV/cm时、转化后复苏培养2h，转化效率最高。对于细胞存放时间，保存前

（责任编辑狄艳红）