角质形成细胞源IL-1α对成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响

　　[摘要]目的：研究角质形成细胞分泌的IL-1α对成纤维细胞生物学行为的影响。方法：组织块法培养成纤维细胞，消化法培养角质形成细胞，采用免疫组化方法检测角质形成细胞分泌的IL-1α；成纤维细胞中加入含不同浓度IL-1α抗体(0．04μg／ml，0．2μg／ml，1μg／ml)的角质形成细胞条件培养液为实验组，含DMEM的条件培养液为对照组，采用Cell counting kit-8、放免法测定成纤维细胞增殖、胶原合成。结果：细胞爬片可见大量染色阳性角质形成细胞，细胞增殖测定，各实验组吸光度(A)值与对照组比较，差异均有统计学意义(ρ＜0．01)；随抗体浓度增高，A值减小，0．2μg／ml及1μg／ml浓度组与0．04μg／ml浓度组比较，差异有统计学意义(ρ＜0．01)；胶原分泌浓度测定，各实验组与对照组比较，差异均有统计学意义(ρ＜0．01)；随抗体浓度及胶原浓度增高，0．2μg／ml及1μg／ml浓度组与0．04μg／ml浓度组比较，差异有统计学意义(ρ＜0．01)。结论：正常角质形成细胞分泌大量IL-1α，可促进成纤维细胞增殖，抑制胶原分泌。 　　[关键词]角质形成细胞；IL-1α；成纤维细胞；细胞增殖；胶原分泌 　　[中图分类号]R329．2+8 [文献标识码]A[文章编号]1008―6455(2006)12-1337-02 　　基金项目：国家自然科学基金资助(编号：30371469) 　　通讯作者：郭树忠，教授，主任医师，博士研究生导师，科主任； 　　E-mail：shuzhong@fmmu．edu．cn 　　 　　角质形成细胞能够促进成纤维细胞增殖并抑制其胶原合成，这种作用是由角质形成细胞分泌的各种活性因子来实现的。但角质形成细胞分泌的每一种因子对成纤维细胞到底有什么具体作用，现在研究的还不是很清楚。IL-1α是角质形成细胞分泌的重要因子，可调节成纤维细胞大量基因的表达，影响多种生物活性因子合成与分泌，也是角质形成细胞-成纤维细胞相互作用环路中的一个主要因子。但其对成纤维细胞的具体作用仍不明确，故我们对其进行了研究。 　　 　　1　资料和方法 　　 　　1．1材料：无血清角质形成细胞培养基(Keratinocyte-SFM，KSFM，Gibco公司，美国)，DispaseⅡ酶(Gibco公司，美国)，DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM，Gibco公司，美国)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，人Ⅲ型前胶原(PCⅢ)放免试剂盒(海研所)，Cell countingkit-8(CCK-8，Dojindo，日本)，IL-1α抗体(R&D公司，美国)，生物素化兔抗山羊IgG和ABC复合物(Vector公司，美国)。 　　 　　1．2细胞培养 　　1．2．1角质形成细胞培养：选用正常小儿包皮组织(来自包皮环切术)，按常规角质形成细胞培养方法培养正常的角质形成细胞。细胞融合达80％～90％时换为无生长因子的角质形成细胞专用培养基，48h后收集上清，-70℃保存备用。用前以DMEM稀释配制成50％的浓度。 　　1．2．2皮肤成纤维细胞培养：用组织块法进行原代培养，常规消化、传代，实验选用第2～10代细胞。新生牛血清浓度为10％。 　　 　　1．3方法 　　1．3．1角质形成细胞源IL-1α测定：采用免疫组化方法。将盖玻片置于6孔板中，加入角质形成细胞(二代)。当细胞爬片融合近80％时取出，0．01mol／L磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffed saline,PBS)浸洗5min×3次，4％多聚甲醛固定15min；再次PBS浸洗5rain×3次，山羊抗IL-1抗体(1u／ml)孵育切片，室温下24h，后用PBS再浸洗5min×3次；生物素化的兔抗山羊IgG(1：400)孵育切片，室温下4h，PBS浸洗5min×3次；生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC复合物，1：500)孵育切片，室温2h。苏木精染液行细胞核衬染，中性树胶封片，光镜下观察。阴性对照：一抗用牛血清白蛋白稀释液替代。 　　1．3．2 IL-1α对成纤维细胞增殖作用测定：采用CCK-8试剂盒。取对数生长期的成纤维细胞。胰酶消化，含10％小牛血清的DMEM调整细胞浓度为5×104／ml,每孔200μl接种于96孔中，过夜后弃去上清，每孔加入DMEM培养24h，细胞处于70％～80％融合状态，弃上清，再加入不同浓度条件培养液(conditioned media，CM)180μl(90μl50％浓度上清液+90μl含不同浓度抗体PBS)，共5组，每组重复6孔，继续培养24h后加入CCK-8 10μl，2～3h后在450nm处测吸光度A值。 　　1．3．3细胞上清液中PCⅢ含量的测定：采用放免试剂盒，取对数生长期细胞，调节细胞浓度为1×105／ml,接种于48孔板中，每孔200μl，过夜后弃去上清换为不同浓度的条件培养液，继续培养1天，取上清液100μl，用放免法测定上清液中PCⅢ的含量。 　　1．3．4统计学处理：采用SPSS10．0统计软件进行统计学处理，数据以互x±s表示。细胞增殖及胶原分泌数据采用两两比较Snq-t检验。 　　 　　2　结果 　　 　　2．1在免疫组化片中，阳性组可见大量胞浆被染成棕黄色的角质形成细胞，以牛血清白蛋白稀释液作为对照的未见明显胞浆阳性细胞(图1、2，见中插2)。 　　2．2角质形成细胞源IL-1α对成纤维细胞增殖的影响：IL-1α对成纤维细胞增殖有明显的促进作用，以IL-1α抗体阻断后，CM促增殖作用减弱；随IL-1α抗体浓度增高，CM促增殖作用渐减弱，在0．2μg／ml时达高峰1ρ＜0．01，2ρ＜0．01)，表1。 　　 　　2．3角质形成细胞源IL-1α对成纤维细胞分泌Ⅲ前胶原的影响 　　IL-1α抑制成纤维细胞胶原分泌，以IL-1α抗体阻断后，CM促胶原分泌增强；随IL-1α抗体浓度增高，分泌胶原浓度增高，在0．2μg／ml时达高峰(3ρ＜0．01，4ρ＜0．01)，表1。 　　 　　3　讨论 　　 　　在炎症期，IL-1α主要是由巨噬细胞分泌，而在伤口愈合后期，主要由角质形成细胞及成纤维细胞分泌，在我们的免疫组化片中，可见到大量染色阳性的细胞，可见在增殖状态的角质形成细胞中，确实合成并分泌大量的IL-1α。 　　IL-1α是角质形成细胞一成纤维细胞相互作用环路中的重要中介物质，角质形成细胞分泌IL-1α，引起成纤维细胞分泌大量的KGF、IL-6，再反作用于角质形成细胞，促进其增殖。在本实验中，发现IL-1α对成纤维细胞的增殖有明显的促进作用，在以中和抗体阻断其作用后，成纤维细胞的

增殖明显受到抑制，而这种作用在0．20μg／ml浓度时达到最强，这与我们以前实验结果相吻合。这可能是由于：①IL-1α作为一个炎性因子，确实可促进成纤维细胞增殖；②IL-1α引起其他生长因子的释放，从而促进成纤维细胞增殖。角质形成细胞与成纤维细胞共同培养时，可引起成纤维细胞343条基因发生变化，其中，69条基因编码一系列生长因子、化学因子、细胞因子及他们的受体。基因表达调高的主要因子有EGF、FGF、VEGF、IL-8、PAL-1、IGFBP-3、PGE等，而大部分因子的变化全部由角质形成细胞源IL-1α介导，其余的由IL-1α部分介导。故IL-1α可通过使这些因子的高表达促进成纤维细胞增殖而促进创面愈合。 　　在胶原合成与分泌方面，IL-1α一直被认为是一个促进胶原降解的因子。以IL-1α抗体阻断其作用后，发现虽然总的成纤维细胞数量减少了，但在上清液中测到的三型前胶原量却增加了。目前，学者认为这主要是由于IL-1α可引起成纤维细胞分泌大量的MMP-1、MMP-3，促进了胶原的降解；同时IL-1α抑制成纤维细胞分泌CTGF，而CTGF是一强有力的促进基质细胞合成胶原的因子。IL-1α的合成减少，正是增生性瘢痕的形成原因之一。Niessen FB测定12个月后仍然呈增生状态的瘢痕发现其表皮层中所含的IL-1α量明显低于正常瘢痕及已渐萎缩的增生性瘢痕，而在3个月时，在基底层及血管周围IL-1α高表达的增生性瘢痕在12个月后趋于正常的可能性明显增高。 　　由此，我们设想在对一些难愈创面或者愈合后瘢痕增生发生几率极高的创面进行治疗时，在早期即投入大量外源性IL―1α，弥补角质形成细胞的分泌不足，或者对这些分泌不足的角质形成细胞进行基因修饰，使其能大量分泌IL-1α，应该能达到促进创伤愈合，减少瘢痕的作用。 　　虽然角质形成细胞分泌的IL-1α介导成纤维细胞一角质形成细胞相互作用，其分泌的多少对创面愈合及增生性瘢痕的产生有密切关系，但创面愈合、瘢痕增生是大量因子的综合作用结果，故我们需要继续对IL-1α及其他重要因子间的协同作用进行进一步研究。 　　 　　[收稿日期]2006-09-14　[修回日期]2006-12-15 　　编辑／张惠娟 　　 　　注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。