酶解法提取虾壳中蛋白质
酶解法提取小龙虾副产物中的蛋白质
摘 要：本文对酶解法从小龙虾副产物中提取蛋白质的工艺条件进行了研究。通过单因素实验和正交实验确定酶解法制备小龙虾副产物中蛋白质的最佳水解条件为：酶解温度50℃，酶解时间3h ，酶与底物比9300u/g，PH=7。此条件下蛋白质的提取率为94.02%。 关键词：龙虾；副产物；蛋白质；酶解。
LI Ya-nan，WANG Hai-bin*，WANG Qi
(College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China)
Abstract:
Key words:chicken lobster; coproduct; enzymatic; protein.
小龙虾是生长在淡水中的甲壳类动物，学名克氏原螯虾，广泛分布于我国湖北、江苏、江西、安徽等长江中下游各省市。虾头、虾壳占虾体重的70%～80%[12]，含有丰富的氨基酸、多肽、蛋白质和其他营养素[11]。
小龙虾虾头蛋白质中必需氨基酸占45.33％，与牛奶蛋白粉的45.69％和酪蛋白的46.14％基本接近[14,15]。是极好的蛋白质来源，具有很高的开发价值[l-3,10,18]。虾头、壳中游离氨基酸的种类较齐全、含量丰富，必需氨基酸含量占游离氨基酸总量的41.52％，必需氨基酸与非必需氨基酸比值为70.99％[16]。
水解动物蛋白(HAP)富含人体所需的各种氨基酸，营养价值高，容易消化吸收，并能很好地保持动物原料固有的风味特点，可作为香精香料的基料或直接用于食品工业，近年来得到迅速发展和广泛应用。[10]
1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1材料
克氏原螯虾虾头：湖北楚玉食品有限公司 碱性蛋白酶：sigma 1.1.2 试剂
双缩脲试剂、氢氧化钠、氯仿、甲醇、缓冲溶液等。 1.2 仪器与设备 万能粉碎机
SHA-C 显数恒温水浴振荡器 V-1100可见分光光度计 智能型台式超声波清洗器 旋转蒸发仪 恒温水浴锅 数显鼓风干燥箱 分析天平 1.3方法
1.3.1 原料预处理
虾壳解冻，淋干水分，放入105℃烘箱中烘干取出，万能粉碎机粉碎备用。 1.3.2 酶解工艺流程
取虾粉5g →加缓冲溶液及酶混合→恒温水浴震荡酶解→冰水浴冷却。 1.3.3 理化指标测定
水分：直接干燥法。GB 5009.3-2010 灰分：高温灼烧法。GB 5009.4-2010 粗脂肪：氯仿甲醇法。
粗蛋白：凯氏定氮法。GB 5009.5-2010
称取虾壳粉5g(两份) ，置于150ml 三角瓶中，加入4% NaOH 30mL，加保鲜膜，于95℃水浴中加热60min ，然后用200—300目的绢布过滤，收集滤液，滤渣倒回三角瓶中，重复上述操作一次，过滤后用适量去离子水冲洗滤渣，合并滤液，置于100ml 容量瓶中定容，用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量。 1.3.4 酶解工艺优化设计
酶法提取蛋白水解物工艺条件的优化
以蛋白水解物得率为评价指标，开展酶用量、酶解时间、酶解温度、酶解pH 、固液比等单一素实验的研究，根据单因素实验结果分析影响酶解的主要因素，设计正交试验，确定最佳水解工艺条件。
单因素实验预设梯度范围：
酶与底物比（相对于干虾壳）：0u/g、1000 u/g、3000u/g、5000u/g、7000u/g、
9000u/g、11000u/g、13000u/g、15000u/g；
酶解时间：0.5h 、1h 、1.5h 、2h 、3h 、4h 、5h ；
酶解温度：20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃； 酶解pH 值：6.4、7、7.6、8.2、8.8、9.4、10、10.6； 固液比：1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50。 实验选取的酶为碱性蛋白酶， 1.3.5 蛋白质提取率的计算
提取率=酶解液中蛋白含量/虾壳中粗蛋白的含量 ×100% 酶解液中蛋白质含量的计算
采用双缩脲法测定酶解液中蛋白水解物的含量[22]。
酶解液中蛋白质含量计算公式：
Y=m1V 1×10-3/m2V 2×100%
Y ：蛋白水解物提取率；
m 1：由标准曲线上查得的蛋白质质量，mg ； m 2：称取样品的质量，g ； V 1：样品定容的体积，mL ； V 2：测定用液的体积，mL 。 2 结果与分析
2.1 虾副产物基本成分的测定
经测定，小龙虾副产物中各成分含量分别为：水分（相对于湿虾，其余指标均为
相对干虾），灰分%，粗脂肪，粗蛋白。 2.2 最佳酶与底物比的选择
图1 酶与底物比对酶解效果的影响
Fig.1 Effect of protease dosage on the extraction drriciency
由图1可以看出，当未加入酶时，蛋白质的提取率很低，随着碱性蛋白酶的加入，蛋白质提取率逐渐升高，说明蛋白质的酶解效果在逐渐升高，虽然之后蛋白质的提取率一直在提高，但蛋白质的酶解效果提升的并不明显，考虑到实际生产中经济与原料的应用，本实验中采用的酶与底物比为9000u/g。 2.3 最适酶解时间的选择
图2 酶解时间对酶解效果的影响
Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction effciency
从表3-6图3-2可以看出，当酶解时间为0.5h 时，蛋白质酶解的效果并不明显，蛋白质的提取率不高，随着时间的增长，酶解效果逐渐明显，当酶解时间为3h 时，酶解效果达到最大，之后一直基本保持不变，故本实验采用的最佳酶解时间为3h 。
2.4 最适酶解温度的选择
图3 酶解温度对酶解效果的影响
Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on extraction effciency
从表3-7 图3-3中可以看出，当酶解温度为21.2℃时，蛋白质的酶解效果并不好，提取率不高，随着温度的增加，蛋白质的酶解程度不断提高，相应的提取率也得到了提升，当温度达到50℃时，蛋白质的酶解效果达到最大，提取率最高，随后，酶解效果开始降低。当温度达到60℃后，蛋白质的提取率又开始增大，这是因为碱性蛋白酶在水中开始水解，在温度为70℃时，水解效果达到最大，随后又开始降低。故本实验采用的酶解温度为50℃。 2.5 最适酶解PH 值的选择
图4 酶解pH 对酶解效果的影响 Fig.4 Effect of pH on extraction effciency
由表3-8 图3-4可以看出，当pH 为6.4时，蛋白质的酶解效果不明显，随着pH 的逐渐增大，蛋白质的提取率也在逐渐提高，说明蛋白质的酶解效果得到提升。当pH=7时，酶解效果最佳，随后，蛋白质的提取率开始逐渐减小。故本实验中采用的酶解pH 为7。 2.6 最适固液比的选择
图5 固液比对酶解效果的影响
Fig.5 Effect of ratio of solid to liquid on extraction effciency
由表3-10图3-6可以看出，当固液比为1：5时，蛋白质的提取率很低，蛋白质的酶解效果不明显，随着固液比的增加，酶解效果逐渐增强，固液比为1:10和1：20时，酶解效果一样，固液比为1：30和1：40的效果相同。当固液比达
到1：30（1：40）酶解效果已经达到最大，随后酶解效果开始减小。故本实验采用的酶解固液比为1：35。 2.7 最佳酶解条件的优化
通过单因素实验，采用酶解时间、酶解温度、酶与底物比及pH 四个因素进行正交实验，以蛋白质的提取率为评价指标，采用L 16(45) 正交实验表对工艺条件进行进一步的优化。
表1 正交实验分析方案及结果
Table1 Result of orthogonal test
试验号
A(酶解温度/℃)
B(酶解时间/min)
C(酶与底物比/u/g)
D(pH值)
E(空列)
Y(蛋白质提取率/%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 K 1 K 2 K 3 K 4 k 1 k 2 k 3 k 4 1(47) 1 1 1 2(50) 2 2 2 3(53) 3 3 3 4(56) 4 4 4 1(150) 2(165) 3(180) 4(195) 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1(8400) 1(6.7) 2(8700) 2(7) 3(9000) 3(7.3) 4(9300) 4(7.6) 2 3 1 4 4 1 3 2 3 4 4 3 1 2 2 1 4 2 3 1 2 4 1 3 1
2 3 4 4 3 2 1 2 1 4 3 3 4 1 2
83.28 89.58 84.00 78.06 84.81 82.95 91.33 90.97 84.03 88.74
93.26 82.58 91.78 83.38 83.94 81.22
334.92 343.90 340.71 340.57 346.93 350.06 344.65 340.91 365.59 346.16 348.61 352.53 342.38 338.77 341.31 340.32 332.83 349.91 328.98 339.51 83.73 87.52 87.15 85.08 85.98 86.16 88.13 83.21 85.18 85.23 85.60 87.48 85.14 86.73 91.40 86.54 84.69 85.33 82.25 84.88
在本实验中，提取率越大越好，由表1可以看出各因素对酶解效果影响D>B>。因此挑选每个因素的K 1、K 2、K 3、K 4中最大的值对应的那个水平，由于：A 因素列：K 3>K2>K4 >K1 ，B 因素列：K 3>K1>K2 >K4 ， C因素列：K 4>K1>K2>K3,D 因素列：K 2>K3>K1>K4，所以，所得优方案为D 2B 3A 3C 4E 2，但是试验中没有最优方案对应的实验号，因此再做一次验证试验，验证试验提取率为93.24%。结果一致。因此最佳酶解条件为：酶解温度52℃，酶解时间3h ，酶与底物比9200u/g，PH=7。
3 结论（讨论）
[1] 姜震, 余顺火, 王荣等. 酶解法提取龙虾废弃物中蛋白质的工艺研究[J]. 现
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