脂肪乳实验
第2章脂肪乳制备技术
一、教学要求
1．掌握生物分离科学的进展、相关项单元操作技术的基本原理。
2. 掌握实验方案设计的基本原则，学会实验方案设计的基本方法。
3．熟练地实施设计方案，优化实验条件。
4．掌握所学技术、方法在药学研究中的应用。
5. 掌握实验数据的统计与处理，学会实验图表的制作方法以及实验结果分析讨论 二、教学学时
计划课内64学时，其中讲授8学时、实验研究56学时。计划课外16学时，其中文献综述10学时、以小组为单位答疑2学时，集中论文交流4学时）
三、讲授的内容
1．载药脂肪乳的组成以及在药物制剂中的研究进展。
2．脂肪乳制备的基本流程和原则。
3．各实验的基本原理，操作步骤和注意事项。
4. 标准曲线的制作方法和要求，
5．在本模块基础上开展蛋白质研究的思路和常用技术、方法。
6. 实验设计和实施的基本的基本要求、注意事项。
四、研究课题
1．氯维地平脂肪乳制剂的处方研究
2．氯维地平脂肪乳制剂的工艺优化
3. 氯维地平脂肪乳制剂的表征及质量评价
4. 氯维地平脂肪乳制剂的稳定性研究
五、主要单元操作技术与设备
1、单元操作技术：剪切乳化、高压均质、微射流
2、主要设备：高剪切分散乳化机、高压微射流纳米分散仪、高压纳米均质机、Zetasizer/Nano-ZS90激光粒度仪、全自动不锈钢立式电热蒸汽消毒器、磁力搅拌器、烘箱、真空干燥箱、分析天平、电子台秤、制冰机、、紫外-可见光分光光度计、荧光分光光度计、高效液相色谱等。
六、教学组织方式
两人一组，所有实验由学生设计方案，独立完成。
七、教学的重点和难点
1、学习的自主性加大，审核学生的实验方案、提供必要的条件。
2、讲授部分的难点是进展、制备思路、原则和常用技术、方法的学习。
3、本模块涉及的仪器特别多，技术方法多，学习难度较大，力求与理论课的对接、举一反三。
八、难点的解决办法：
1、认真备课，该讲的讲深、讲透，重点一对一答疑。
2、做好设计报告的审核，提前一个月做好仪器检修和药品的准备。
3、做好必要的单元操作示教和研究过程的现场指导。
九、相关参考书 1、孙彦，生物分离工程；
2、严希康，生化分离技术；
3、谭天伟，生物分离技术
4、李建武，生物化学原理和方法；
5、生物分离工程实验指导
2—1氯维地平脂肪乳的处方研究
材料与方法
1 实验材料
T-18basic 高剪切分散乳化机（IKA ）；
M100 PCE高压微射流纳米分散仪（Microfluidics ，USA ）；
高压纳米均质机（广州聚能生物科技有限公司）
YM50全自动不锈钢立式电热蒸汽消毒器（上海三申）；
DF-101S 磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）；
Zetasizer/Nano-ZS90激光粒度仪（Malvern ，英国）；
蛋黄卵磷脂（Lipoid E80，供注射用）
甘油（江西益普生药业有限公司，供注射用）
EDTA-2Na （阿拉丁）
油酸（Lipoid ，供注射用）
油酸钠（Lipoid ，供注射用）；
2 实验方法
通过单因素实验，以外观、粒径、粒径分布、zeta 电位、游离脂肪酸等指标来评价，研究并探讨了油相、稳定剂以及抗氧剂对氯维地平脂肪乳的影响。
2.1处方组分的选择
以美国FDA 批准上市的氯维地平静脉注射用脂肪乳处方为参考（见下表），在此基础上，选择对制剂影响较大的关键组分进行优化。
美国 FDA 批准上市的氯维地平静脉注射用脂肪乳处方
2.1．1油的种类和用量考察
大豆油和 MCT 是脂肪乳常用的油相，以基础处方作为基本处方，改变油相，制备氯维地平脂肪乳，考察不同油相比例对乳剂的粒径等稳定性指标的影响。
2.1.2稳定剂的种类和用量考察
油酸、油酸钠是乳剂中常用的的稳定剂，以基础处方作为基本处方，改变稳定剂的种类和用量，制备氯维地平脂肪乳，分别考察不同稳定剂及其用量对乳剂的粒径等稳定性指标的影响。
2.1.3抗氧剂的种类和用量考察
由于脂肪乳中油和磷脂均易于空气中氧气反应，所以加入抗氧剂保护。选用注射液中常用的水溶性抗氧剂硫代硫酸钠、脂溶性抗氧剂 VE 以及两亲性抗氧剂硫辛酸进行对比，以基础处方作为基本处方，改变抗氧剂的种类和用量，制备氯维地平脂肪乳，然后在 60℃条件下放置 10 天，取样测定粒径、PDI 、zeta 电位等各项指标，考察抗氧剂种类对氯维地平脂肪乳稳定性的影响，并进一步研究其最适合的用量。
2.1.4EDTA-2Na 的用量
在脂肪乳的制备过程中，尤其是剪切、匀质等过程，容易引入微量金属离子，金属离子会促进油脂氧化。金属离子螯合剂 EDTA-2Na 能与微量金属离子络合，具有提高油脂抗氧化及防止变色的作用。参考相关文献以及美国 FDA 批准上市的处方选择用量 0.005%
2.2 质量的评价指标及方法
2.2.1外观
氯维地平脂肪乳制剂的外观应为乳白色，均匀，流动性良好。
2.2.2粒径
静脉注射用乳剂属于热力学不稳定体系，根据粒径可以判断是否符合静脉注射的要求，据粒度分布可以对制剂的均一稳定性进行预测。
不同用途的乳剂对粒径大小要求不同。综合分析多种上市静脉注射用乳剂的质量标准，对于粒径和粒度分布的要求多为用库尔特计数器或激光粒度仪测定，大多数乳粒应在 0.5 μm 以下，在大于 0.5 μm 的乳粒总数中，大于 1 μm 的乳粒数不得超过 3％，并不得检出大于 5 μm 的乳粒。
本实验过程将氯维地平脂肪乳用超纯水稀释一定的倍数，通过激光粒度仪进行粒径的测定。
2.2.3zeta 电位
zeta 电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差，它是对颗粒之间排斥力强度的度量，因此 zeta 电位是衡量体系稳定性的一个重要指标。目前测量 zeta 电位的方法主要有电泳法、电渗法、流动电位法以及超声波法，其中以电泳法应用最广。正负电荷符号都可以形成高 zeta 电位，即＜-30 mV 和＞+30 mV 都将视为高 zeta 电位。高 zeta 电位意味着较高的稳定性，稳定性较好的分散液具有抗凝聚性。
2.2.4游离脂肪酸
磷脂和植物油在制备、灭菌以及贮藏过程中均会水解，产生游离脂肪酸，导致脂肪乳 pH 值降低，pH 的降低显著降低磷脂的离子化程度，引起 zeta 电位的降低，从而导致脂肪乳不稳定，因此其含量反映了乳剂的稳定性。常用尼罗蓝法来测定游离脂肪酸含量，其浓度不得超过 5 mmol/L。
具体方法：（1）尼罗蓝显色剂的配制：称取尼罗蓝 0.01 g 溶解于 50 ml 水中，加正庚烷 25 ml 振摇，弃去上层正庚烷，反复操作
约 4 次，直到正庚烷层无色。取下层水溶液 10 ml ，加无水甲醇 90 ml ，混匀。本液置棕色瓶中，室温下可存放一个月。
（2）对照品溶液配制：取 0.12821 g 棕榈酸置于 25 ml 容量瓶中，加正庚烷溶解，并稀释至刻度线，即得 20 mmol/L 的溶液，再将该溶液稀释至不用的浓度。分别取 20mmol/L 溶液 5、2.5、1.25 ml 和 2.5 mmol/L 溶液 5、2.5、1.25 ml 至 10 ml 容量瓶中得到 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3175 mmol/L 的一系列标准溶液。
（3）精密量取不同浓度（x ）的对照品溶液各 1 ml ，分别置 20 ml 具塞试管中，加异丙醇-正庚烷-0.5mol/L 硫酸溶液(40:10:1)的混合溶液 5.0 ml 振摇 1 分钟，放置 10 分钟（硫酸作用：将乳剂中的脂肪酸钠水解为脂肪酸，以测定全部的游离脂肪酸含量）。加正庚烷 2 ml和水 4 ml，密塞，上下翻转 10 次，静置 15 分钟，使分层，分别精密量取上层液 3ml，加入 1 ml 尼罗蓝指示剂，用 0.01 mol/LNaOH 滴定液滴定，至溶液低端由蓝色变为淡紫色，读出所用氢氧化钠的体积（y ），以 xy 作图，得游离脂肪酸的标准曲线。
（4）量取样品 1 ml（平行共 2 份），置 20 ml 具塞试管中，加异丙醇-正庚烷-0.5mol/L 硫酸溶液(40:10:1)的混合溶液5.0ml 振摇1分钟，放置10分钟。加正庚烷3 ml和水3 ml，密塞，上下翻转 10 次，静置 15 分钟，使分层，精密量取上层液 3 ml ，加入 1 ml 尼罗蓝指示剂，用 0.01 mol/LNaOH 滴定液滴定，至溶液低端由蓝色变为淡紫色，读出所用氢氧化钠的体积，代入标准曲线，计算得游离脂肪酸浓度。
注意：样品溶液若按照步骤 4 操作，上层液 3 ml 浑浊，可能会影响滴定时颜色的判断，这是由于样品杂质过多，这时可采取两步萃取，即量取分层后的上层液 1 ml再按照步骤 3 进行操作！若实
验过程中未出现浑浊，可采取一步萃取。
2.2.5过氧值
脂肪乳的油和磷脂中脂肪酸不饱和程度较高，容易发生氧化。脂质氧化后，乳化性能降低，进而影响脂肪乳的物理稳定性，且氧化后生成的过氧化物和氢过氧化物具有一定的毒性，国家标准中要求控制其量。过氧化值多采用碘量法进行滴定测量，过氧化值一般不超过
2.5 mmol/L。
具体方法：（1）碘化钾饱和溶液的配制：碘化钾在 20℃的时候溶解度是 144 g，量取 10 ml 水，加入 14.4 g 碘化钾，溶解，即可配置成碘化钾的饱和溶液（保证有晶体存在）。（2）1%淀粉指示剂的配制：称取 1.0 g 可溶性淀粉，加少量纯化水搅匀，随后一边搅拌，一边加入约 60 ml 热水，再将此溶液煮沸 2~3 min，静置冷却后，加入 NaCl 20 g ，溶解后加纯化水补充至 100 ml （可冷藏备用）。
（3）参照国家药品标准，取冰醋酸-氯仿（6:4）混合液 30 ml ，置 250 ml 碘瓶中，密塞。精密量取样品 5 ml ，迅速加入混合液中，轻轻振摇，加碘化钾饱和溶液 0.5 ml，密塞，振摇 1 min，加新沸过的冷水 30 ml 与 1%淀粉指示剂 2 ml 。用硫代硫酸钠滴定液（0.01 mol/L）滴定至蓝紫色消失，消耗的硫代硫酸钠滴定液不得超过 1.0 ml。注意用除去空白消耗NaOH 的干扰。
过氧化值（mmol/L）=
式中： V 为样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积（ml ）；
Vo 为空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积（ml ）；
W 为供试品的取样量（ml ）。
2.2.6甲氧基苯胺值
甲氧基苯胺值是反映过氧化物分解成醛酮类物质的一项指标。油
中的不饱和脂肪酸被氧化后会形成过氧化物，进一步分解生成醛类或酮类物质，对人体肝功能有损害。基于甲氧基苯胺与脂肪酸的氧化产物脂肪醛反应生成醇胺，醇胺脱水生成的醛亚胺可在 350 nm 处用分光光度计测定这一原理，可间接计算出脂肪酸氧化产物醛类或酮类物质的量。已有厂家标准控制甲氧基苯胺值不超过 2.2。
具体方法：（1）甲氧基苯胺醋酸溶液的配制：称取适量对氨基苯甲醚（0.25 g ）置 100 ml 量瓶中，加冰醋酸溶解并稀释至刻度，得 0.25%甲氧基苯胺醋酸溶液。（2）精密量取 10 ml 样品于圆底烧瓶中，加入 20 ml 甲醇，旋蒸除尽水分（需要重复操作3 次），残渣加 20%异丙醇-异辛烷溶液溶解并稀释至 25 ml，摇匀，过滤得供试品。在 350 nm 处，以 20%异丙醇-异辛烷溶液做空白，测定供试品的吸收度 A0。（3）吸取 5 ml 供试品溶液至试管中加 1 ml 甲氧基苯胺醋酸溶液，加塞振摇，密闭放置 15min，以 20%异丙醇-异辛烷溶液：醋酸=5:1 的混合液为空白，于 350 nm 处测定吸收度 A，计算甲氧基苯胺值。
甲氧基苯胺值=
式中：V 为供试品的取样量，ml ；
B 为供试品中大豆油的标示量，g/ml；
1.2 为加入 0.25%甲氧基苯胺的冰醋酸溶液后的溶液稀释因子。
2.2.7 含量测定
精密量取氯维地平脂肪乳 0.5 ml 于 10 ml 量瓶中，加适量甲醇振摇破乳，稀释并定容至刻度，摇匀。以 5000 rpm 离心 5 min，取上清液即为待测样品。氯维地平检测按照已建立的 HPLC 测定方法进行。
色谱条件为：色谱柱为 TC-C18 柱 (5 μm, 4.6 × 250 mm)，
流动相为甲醇-水（80 : 20，v/v），流速为 1 ml/min，柱温为 25 ℃，检测波长为 364 nm，进样量为 20 μl 。
1.3 结果与讨论
2-2氯维地平脂肪乳的工艺研究
氯维地平静脉注射用脂肪乳处方
实验材料与方法
1 实验材料
T-18basic 高剪切分散乳化机（IKA ）；
M100 PCE高压微射流纳米分散仪（Microfluidics ，USA ）；
高压纳米均质机（广州聚能生物科技有限公司）
YM50全自动不锈钢立式电热蒸汽消毒器（上海三申）；
DF-101S 磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）；
Zetasizer/Nano-ZS90激光粒度仪（Malvern ，英国）；
蛋黄卵磷脂（Lipoid E80，供注射用）
甘油（江西益普生药业有限公司，供注射用）
EDTA-2Na （阿拉丁）
油酸（Lipoid ，供注射用）
油酸钠（Lipoid ，供注射用）；
2 实验方法
2.1 初乳工艺优化
初乳质量的好坏直接影响到终乳的稳定性，采用较优的处方制备乳剂，考察初乳制备工艺。
2.1.1油水相的制备
（1）磷脂的加入方式有加入油相或加入水相，试验中发现将磷脂加入水中剪切分散后制备的初乳放置 5 min 很快分层；而加入油相剪切时，油相产生太多泡沫，无法加入水相；借助有机溶剂溶解后还要将最终的样品旋蒸除去溶剂，使过程变得繁琐，不仅在高温旋蒸影响样品的稳定性，
若残留少量有机溶剂则影
响样品的长期稳定性。最终选择将卵磷脂直接加入油中低速搅拌溶解，尽量将温度控制在卵磷脂的相变温度（75℃）附近，可以使溶解速度加快。
（2）由于油相温度为 75℃，水相制备温度要尽量与油相温度接近，否则不利于乳剂的形成。因此选用 70℃为制备水相的温度。
2.1.2剪切工艺
以不同的转速（11000、15500、20000 rpm ）制备初乳，并在不同时间点（1、3、5、10、20、30 min）取样，测定初乳粒径、PDI 。
2.2 均质工艺
2.2.1匀质设备选择
采用优化的脂肪乳处方和剪切工艺，采用高压匀质机和高压微射流两种不同的 设备在相同压力及循环次数的条件下制备乳剂，考察匀质设备对乳剂粒径及其分布的影响。
2.2.2匀质参数优化
采用优化的脂肪乳处方，选择较优的匀质设备，制备乳剂，考察匀质工艺如压力和循环次数对氯维地平静脉注射脂肪乳粒径及其分布的影响。
2.2.3脂肪乳 pH 值优化
为了使样品的 pH 值与人体血液 pH 接近，必须保证最终的样品 pH 在 6~8，考虑到在制备、灭菌以及储藏过程中 pH 值会下降，pH 值应调节至稍高。处方前研究结果说明氯维地平在 pH 5~10 范围中相对较稳定。
因此调节氯维地平脂肪乳 pH 至不同的值，灭菌后（121℃、15min ）考察乳剂pH 值对脂肪乳的 zeta 电位的影响。
2.2.4灭菌工艺优化
静脉注射用乳剂要求产品保持无菌。灭菌的方法、温度、时间及灭菌时的 pH 值等都会影响到乳剂灭菌的稳定性。本实验采用热压灭菌工艺对氯维地平脂肪乳进行灭菌，以粒径大小及分布、zeta 电位和药物含量为指标，考察 115℃下 30 min 和 121℃下 15 min 的热压灭菌工艺对氯维地平静脉注射乳剂的影响。
3. 结果与讨论
2-3氯维地平脂肪乳的表征与质量评价
对药物制剂进行质量评价可以为制定制剂的质量标准提供依据，对其进行表征 则可以进一步研究药物制剂的微观结构。
测定氯维地平脂肪乳制剂的粒径分布、zeta 电位、游离脂肪酸等指标，并用 TEM、DSC 、XRD 等进行表征。
1仪器与试剂
Tecnai G2 20 透射电子显微镜（FEI 公司，荷兰）；
DSC-7 差热分析仪(Perkin-Elmer 公司，美国) ；
Labconco 6L 冷冻干燥系统（Labconco 公司，美国）；
D/MAX III B 粉末衍射仪（Rigaku 公司，日本）；
其他实验仪器同前
2. 实验方法
2.1质量评价
以外观、粒径、电位、游离脂肪酸、过氧化值、甲氧基苯胺值以及药物含量为 指标对氯维地平脂肪乳进行质量评价。
2.2 表征
2.2.1 透射电镜（TEM ）
制样方法：将氯维地平脂肪乳样品稀释 500 倍，摇匀。用微量移液枪取约 3 μl 滴于铜网上，用灯烘干后，滴 5 μl 磷钨酸溶液（2%，w/v）于铜网上，染色 5 min ，再次烘干即可。
2.2.2 示差扫描量热法（DSC ）
制备样品方法：1、将脂肪乳制剂加入 20%海藻糖作为冻干保护剂，涡旋溶解；2、将空白乳和载药乳先置于-20℃冰箱预冻 8 小时，再置于-80℃超低温冰箱冷冻一天；3、置于冷冻干燥机中-40℃升华，冷冻干燥三天，待样品完全干燥，将样品拿出备用。
准备四个冻干粉末样品待做 DSC ：
1、氯维地平原料药；
2、空白制剂冻干粉末；
3、空白制剂冻干粉末与氯维地平原料药的物理混合粉末；
4、氯维地平脂肪乳制剂粉末。
条件：在 0~200℃温度范围内测定，升温速度为 10℃/min。
2.2.3 X 射线衍射分析（XRD ）
按 5.3.2.2 项下的方法制备冻干样品，XRD 实验条件为：Cu-K α辐射，工作电压40 kV、50 mA，扫描范围为 5°~ 50°（2θ），扫描速度为 10°/min，步长：0.02 °/步。
3．结果与讨论
2-4氯维地平脂肪乳的稳定性
根据中国药典 2010 版二部附录药物稳定性试验指导原则，进行制剂的影响因素、加速试验；并研究制剂在生理盐水及葡萄糖注射液中的稀释稳定性。
1. 仪器与试剂
氯化钠（分析纯，国药）；
葡萄糖（分析纯，国药）；
其它仪器试剂同前
2. 实验方法
2.1影响因素试验
2.1.1 高温试验
取经过充氮灌封、灭菌的氯维地平脂肪乳置于 60℃条件下放置 10 天，分别在0天和第 10 天取样，考察其粒径、电位以及游离脂肪酸等指标。
2.1.2 低温试验
取经过充氮灌封、灭菌的氯维地平脂肪乳置于 4℃条件下放置 10 天，分别在 0天和第 10 天取样，考察其粒径、电位以及游离脂肪酸等指标。
2.1.3 冷冻试验
取经过充氮灌封、灭菌的氯维地平脂肪乳置于-20℃条件下放置 10 天，分别在 0天和第 10 天取样，考察其粒径、电位以及游离脂肪酸等指标。
2.1.4 光照试验
取经过充氮灌封、灭菌的氯维地平脂肪乳置于 4℃，4500±500 lx 光照条件下放置 10 天，分别在 0 天和第 10 天取样，考察其粒径、电位以及游离脂肪酸等指标。
2.2 留样加速试验
按照 2010 版中国药典稳定性研究指导原则，将氯维地平脂肪乳置于 30℃稳定性试验箱中，于第 0、2 月取样，考察其粒径、电位以及游离脂肪酸等指标。
2.3 稀释稳定性
氯维地平脂肪乳为静脉注射制剂，临床应用时常稀释使用，稀释后的稳定性非常重要。将氯维地平脂肪乳与 0.9%生理盐水或 5%葡萄糖溶液按照不同比例（1:10、1:20、1:40）混合，并用超纯水稀释同样的比例作为对照组，均装瓶密封。将其置于4℃下 24 h ，然后取出置于室温 24 h，取样，测定乳液的粒径及 PDI。
3. 结果与讨论