第十一章 细胞核和染色体思考题
第十一章 细胞核和染色体思考题
1.试述核被膜的超微结构及功能?
答:核被膜是包被核内含物的双层膜结构,电镜下的结构组成包括外核膜、内核膜、核间隙、核纤层和核孔复合体。①外核膜:厚约6~8nm ,其胞质面有的部分附有核糖体,结构类似粗面内质网。外核膜并认为是内质网膜的特化区域,外表面亦有核糖体附着,可进行蛋白质的合成。外核膜的外表面可见有中间纤维形成的细胞骨架网络,与细胞核在细胞内的定位有关。②内核膜:是核被膜中面向核质的一层膜,较外核膜平整光滑,与外核膜平行排列,外表面无核糖体附着。其内侧有一层致密的纤维状网络叫做核纤层。③核周隙:内外核膜之间的腔隙,宽约20~40nm ,内含多种蛋白质和酶。④核孔:是内外膜相互融合而成的圆环状结构。电镜下显示为复杂而有规律的结构,由一组蛋白质颗粒以特定方式排列而成,成为核孔复合体。⑤核纤层:是附着于内核膜下的纤维蛋白网。此层电子密度较大,是由10nm 粗细的中间丝纵横排列交织成网的纤维蛋白质,一侧结合于内核膜的特殊部位,另一侧与染色体的特殊位点结合。对核膜有支持作用,并与染色质及核组装有密切关系。核被膜具有以下多种功能:①核被膜是细胞核和细胞质之间的屏障,内、外核膜的脂质双层分子可阻挡极性分子通过,并有避磁、避电及保持核内pH 的作用;②核周隙是物质之间理化缓冲区,维持核内DNA 复制,转录活动的稳定微环境;③核被膜有物质交换作用,核质之间的水、离子、甘油、蔗糖等小分子物质可迅速通过核膜,而大分子物质可以主动运输、膜泡方式转运;④核被膜上附有多种三大代谢所需的酶和能量代谢酶,与DNA 复制、转录、蛋白质合成有关的酶都位于核膜;⑤核膜还是基因表达调控的阀门,核内信息通过mRNA 经核孔流向细胞质,控制蛋白质的合成,因而核孔可控制信息流量。核孔同时还可介导细胞核与细胞质间的物质运输。
1. 在细胞水平上原核细胞与真核细胞的主要差异是什么?
答: 原核生物没有真正的细胞核, 而只有拟核(nucleiod)。在细胞水平上原核和真核有三方面主要差别: ①核膜: 真核细胞有核膜, 原核细胞没有核膜, 称之为拟核; ② 核仁: 真核细胞有核仁, 原核细胞无核仁; ③核内遗传物质的存在状态: 真核细胞内DNA 同组蛋白结合, 有染色体结构;原核近年也发现同蛋白质结合, 但无染色体结构。
2. 核被膜的形成对细胞的生命活动具有什么意义?
答: 主要有以下三方面的意义:①基因表达的时空隔离
在原核生物中, 基因表达是连续进行的, 即mRNA 的转录和蛋白质的合成相偶联。这主要是因为原核细胞结构简单, 原核生物的基因转录物无须经过剪接。真核生物的结构复杂, 而且大多数基因都有内含子, 转录后需要经过复杂的加工, 所以核膜的出现, 为基因的表达提供了时空隔离的屏障, 便于DNA 在核内活动的多样性。②核膜作为保护性屏障, 使核处于一微环境中细胞核是在进化过程中形成的。在细胞的遗传信息储存量越来越丰富以及由遗传信息所指导的代谢规模越来越大的情况下,有必要将携带遗传信息的染色质与细胞的其它部分隔离开来。核膜的出现,为细胞遗传信息的保存、复制、传递及发挥其对细胞代谢和发育的指导作用创造了特定的微环境,提高了上述各项活动的效率;避免直接受细胞内其它各种生命活动的干扰,并防止细胞中这个调度中枢的功能轻易地随环境条件的变化而变化,以保持其相对的稳定性,这些都是核膜出现的进化意义。③染色体的定位和酶分子的支架染色质通过核纤层同核膜相连, 使之多而不乱, 保证了有序性。另外, 核内的一些酶是以膜蛋白的形式存在的, 这就有利于核内生
化反应的区域化, 从而发挥高度的催化活性。所以核膜是染色体和酶分子的支架和固着部位。
3. 根据对核蛋白运输机制的研究及相关蛋白的发现, 提出了核蛋白的运输模型(图Q11-1), 请对这一模型作出文字说明(PCC1:Ran nucleotide-exchange factor1)。 答: 按照这一推测的模型,在细胞质中的核运输蛋白α、核运输蛋白β和货物蛋白(cargo protein )相互作用形成一个运输复合物,其中运输蛋白α亚基识别并与NLS 结合。而运输蛋白β亚基与核孔复合物作用,将复合物转运到细胞核中。在此过程中需要消耗ATP 。在细胞核中,Ran?GTP (一种小GTP 结合蛋白)与输入蛋白β亚基相互作用,导致货物蛋白与复合物脱离,成为细胞核中的游离蛋白。为了进行下一个运输循环,输入蛋白α亚基和输入蛋白β亚基-Ran?GTP 复合物重新回到细胞质。细胞质中的Ran?GTP-激活蛋白(RanGAP )将Ran?GTP 转变成Ran?GDP, 并使Ran?GDP 与输入蛋白β亚基脱离,游离的输入蛋白β亚基和α亚基一起参与新的具有NLS 信号的入核蛋白的运输。而Ran?GDP 可通过核孔复合物回到细胞核中,在Ran 核苷交换因子1(Ran nucleotide-exchange factor1,RCC1) 的作用下,释放GDP, 重新结合GTP 。
4. 某些hn-RNP 蛋白具有输出信号(NES), 促进通过核孔的主动运输。图Q11-2是含有丰富亮氨酸的NES 穿梭蛋白的核输出模型。请对此模型进行文字说明(RCC1:Ran nucleotide-exchange factor1)。
答: 按照这一模型, NES通过与细胞核中特异的核输出受体, 即核输出蛋白1的结合促进货物蛋白从细胞核向细胞质运输。核输出作用还需要第三种蛋白, Ran 蛋白, 是一种小GTPase, 它与GTP 或GDP 结合时的构型是不同的。 输出蛋白1能够同时与Ran?GTP 和货物蛋白的NES 作用, 形成三分子的货物复合物。然后三体复合物通过至今尚不清楚的机制通过核孔。一旦Ran?GTP/输出蛋白1/货物蛋白复合物到达胞质溶胶, Ran GTPase 激活蛋白(RanGAP)促进Ran 水解与之结合的GTP, 形成GDP, 致使Ran 蛋白产生构型的变化, 使三体复合物解散, 最后将货物蛋白释放出来。游离的输出蛋白1和Ran?GDP 重新通过核孔回到细胞核, 在细胞核中Ran 核苷交换因子(Ran nucleotide-exchange factor1,RCC1) 使Ran 释放GDP 结合上GTP, 开始下一轮的运输作用。
5. 分子伴侣种类很多, 它们在结构上具有哪些共同的特点?
答: 共同点有:①家族成员具有高度保守性 如Hsp70家族是由一类高度保守的蛋白质组成,广泛分布于真核生物和原核生物中。在果蝇、酵母、鸡、哺乳动物、锥虫和细菌等生物细胞中检测发现,甚至在具有最远亲缘关系的真核生物中的Hsp70的序列一致性也达到了50%。而原核生物的分子伴侣Dnak 与真核生物的分子伴侣Hsp70同源性也高达50%。Hsp60家族中大肠杆菌细胞质分子伴侣GroEL 与真核生物线粒体基质分子伴侣cpn60的同源性达到60%。②家族成员结构上具有相似性如Hsp70家族成员都折叠成两个功能结合区域?ATP 结合域和底物结合结构域;结晶X -射线分析和电镜观察Hsp60家族中GroEL 与cpn60的结构,发现它们都是由十四个相对分子质量60kDa 的蛋白质亚基构成两个七元环,再堆叠形成圆筒状的14-聚体,中央形成空穴,推测空穴与它们帮助蛋白质折叠的功能有关,可能是提供折叠的场所。③组成型表达家族成员大部分在体内为组成型表达,在刺激条件下会被进一步诱导。Hsp60、Hsp70、Hsp90在细胞内含量丰富,正常情况下GroEL 可占细胞总蛋白质含量的1~2%,热诱导下最高可达10~15%;cpn60占线粒体基质蛋白质总量的1%。也有例外,如Hsp70家族成员Hsp72只是诱导产物,正常情况下在细胞中含量很低。这与它们在细
胞中所起的作用有关。④ 家族成员都具有可被底物激活和增强的弱的ATP 酶活性 这一特性与它们在作用过程中与ATP 结合水解循环过程偶联有关,Hsp70的K +依赖的A TP 酶活性在它与底物结合时增加2~20倍。
6. 举例说明分子伴侣在应激反应中的作用。
答: 这方面的例子很多。如大肠杆菌中DnaK 基因缺失严重地降低了细胞在30℃的生长速度,在40℃则生长完全被抑制。野生型的大肠杆菌在42℃条件下预处理5分钟将明显提高菌株在50℃条件下的存活率。酵母Hsp104基因突变体暴露在50℃下几分钟其死亡的速率是野生型细胞的100~1000倍,同时这种突变体对乙醇的耐受力下降了1000倍。用人类组成型表达的Hsp70基因转化的鼠细胞和猴细胞,明显提高了耐热能力。对于热激蛋白在热休克反应(heat shock response)中的作用机制已研究得比较深入,但还不能准确描述其中关键的生物过程。免疫荧光标记法确定真核生物的Hsp70集中于膜上、核质和核仁中,同时在酵母无细胞提取液中纯化的Hsp70可以修复因热诱导被破坏的核功能如mRNA 的剪接。热休克后的果蝇属(Drosophila) 生物组成型表达的Hsp70可以加快核形态的恢复,对脊椎动物进行微注射Hsp70可使mRNA 在短时热激条件下存活能力提高。热处理主要是破坏mRNA 合成、rRNA 合成和蛋白质的合成与降解。由此可见分子伴侣在热激反应中的作用首先是恢复细胞转录和翻译的机能。Sherman 和Goldberg 等人的研究结果表明分子伴侣DnaK 等不仅可与变性蛋白结合,阻止它们聚集,还作为蛋白酶酶解的识别要素,使被破坏的蛋白质能被快速降解掉,减少了被破坏的蛋白与功能蛋白间发生有害作用的可能性,防止不溶蛋白聚集积累,同时无功能蛋白质释放的游离的氨基酸可供新的蛋白质的合成。说明分子伴侣不能帮助未折叠的中间物获得正确的折叠途径时,它们就加速中间物的降解,保证体内环境的稳定。
7. 举例说明分子伴侣是如何参与信号转导? 机理如何?
答: 研究证明, 一些脂溶性信息分子在细胞质中的受体有三个位点:同信息分子结合的位点(hormone binding site) 、同DNA 结合的结构域(DNA binding domain) 以及核定位信号位点(nuclear localization), 所以受体本身就是核定位蛋白。当细胞未受到激素激活时, 受体是同伴侣蛋白结合在一起的, 核定位信号和DNA 结合位点都被隐蔽起来。当细胞受到信号分子作用(如激素), 脂溶性的激素进入细胞质, 同相应受体上的激素结合位点结合, 使受体同伴侣蛋白脱离, 露出核定位信号位点和DNA 结合位点。然后, 核定位蛋白通过核孔进入细胞核, DNA 结合位点同染色体上的DNA 结合, 启动基因的表达。 例如糖皮质(激) 素受体(glucocorticoid receptor), 其本身就是一个基因表达的调节蛋白, 在没有激素作用时, 同分子伴侣Hsp90结合, 存在于细胞质中。当细胞受到激素作用后, 激素进入细胞质, 并同受体结合, 使之与伴侣蛋白分开, 这样, 受体可进入细胞核调控基因的表达。
8. 5种组蛋白在结构和功能上有什么异同?
答: 组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白, 是一类小分子碱性蛋白质, 有五种类型:H1 、H2A 、H2B 、H3 、H4(表11-4),它们富含带正电荷的碱性氨基酸, 能够同DNA 中带负电荷的磷酸基团相互作用。5种组蛋白在功能上分为两组:一组是核小体组蛋白(nucleosomal histone), 包括H2A 、H2B 、H3和H4, 这四种组蛋白相对分子质量较小(102~135个氨基酸残基), 它们的作用是将DNA 分子盘绕成核小体。它们没有种属及组织特异性, 在进化上十分保守, 特别是H3和H4是所有已知蛋白质中最为保守的。H1属于另一组组蛋白, 它不参加核小体
的组建, 在构成核小体时起连接作用, 并赋予染色质以极性。H1有一定的组织和种属特异性。H1的相对分子质量较大, 有215个氨基酸残基, 在进化上也较不保守。
9. 什么是非组蛋白? 它有哪些特性和功能?
答: 非组蛋白是指细胞核中组蛋白以外的酸性蛋白质。非组蛋白不仅包括以DNA 作为底物的酶,也包括作用于组蛋白的一些酶, 如组蛋白甲基化酶。此外还包括DNA 结合蛋白、组蛋白结合蛋白和调节蛋白。由于非组蛋白常常与DNA 或组蛋白结合, 所以在染色质或染色体中也有非组蛋白的存在, 如染色体骨架蛋白。非组蛋白是一类不均一的蛋白质,约有500多种不同的组分。一般说来,所含酸性氨基酸超过碱性氨基酸,故呈酸性,带负电荷。另外, 非组蛋白常常是被磷酸化的。由于非组蛋白具有调节作用, 所以它们是异质性的, 具有组织特异性和发育阶段的特异性, 且在活动染色质中的含量要比在不活动染色质中的含量高。非组蛋白是一类特异的转录调控因子,参与基因的选择性转录表达。非组蛋白具有多种功能。参与染色体的构建: 这方面的作用与组蛋白相辅佐。组蛋白把DNA 双链分子装配成核小体串珠结构后, 非组蛋白则帮助折叠、盘曲, 以形成在复制和转录功能上相对独立的结构域。启动基因的复制: 这些蛋白质往往以复合物的形式结合在一段特异DNA 序列上, 复合物中包括启动蛋白、DNA 聚合酶、引物酶等, 作用在于启动和推进DNA 分子的复制。调控基因的转录: 这些蛋白一般为基因调控蛋白(gene regulatory protein), 它们往往以竞争性或协同性结合的方式, 作用于一段特异DNA 序列上, 即多种蛋白分子或一种蛋白的多个分子间存在着竞争或协同的关系, 以调节有关基因的表达。
10. 有人根据实验结果, 提出在DNA 转录时, 通过成环机制, 核小体是全保留的(图Q11-3), 请对成环机制作出文字说明。
答: 基本过程是: 1. RNA聚合酶在启动子P 位开始转录,B 表示核小体的边界; 2. 当RNA 聚合酶接近核小体时,诱导紧挨核小体的DNA 与核小体脱离,露出组蛋白8聚体的表面;3. 露出的组蛋白8聚体表面与RNA 聚合酶后面的DNA 结合,因而形成一个环;4. 当RNA 聚合酶继续前进时,转录过的DNA 象络纱一样围着组蛋白8聚体缠绕;5. RNA聚合酶后的DNA 重新形成核小体,转录完成。
11. 核小体中核心组蛋白赖氨酸残基乙酰化如何影响DNA 的转录?
答: DNA的转录首先需要核心组蛋白的乙酰化, 才能解除组蛋白对启动子区的抑制。一些转录因子, 如糖皮质激素受体(glucocotticoid receptor, GR)与DNA 结合, 引起共激活子(如CBP) 的结合, 而CBP 具有组蛋白乙酰基转移酶的活性(这些酶以乙酰辅酶CoA 作为乙酰基供体转移到组蛋白的赖氨酸残基), 引起核心组蛋白的赖氨酸残基乙酰化。基因在未进行转录时, 被去乙酰化组蛋白核小体结合从而抑制了启动子的作用。转录因子受体(如糖皮质激素受体,GR) 同GRE 结合, 引起CBP 同GR 结合, 导致TA TA 盒上游和下游核小体中的组蛋白乙酰化; 乙酰化的组蛋白与DNA 脱离; TFⅡD 与DNA 的开放区结合, TFⅡD 的一个亚基(TAFⅡ250) 也具有乙酰转移酶的活性。CBP 和TAF Ⅱ250一起使更多的核小体组蛋白乙酰化, 启动转录。剩下的与启动子结合的核小体被乙酰化, RNA 聚合酶与启动子结合, 转录开始。
12. DNA包装成染色体大约压缩了7倍, 请说明计算的依据。
答:依据是: 一个核小体的直经是10nm, 由200个碱基对的DNA 组成, 每个碱基对长度为0.34nm, 一个核小体伸展开来的长度是70nm, 因此, DNA 包装成核小体, 大约压缩了7倍。
13. 灯刷染色体形成的生物学意义何在?
答: 灯刷染色体的形态与卵子发生过程中营养物储备是密切相关的。大部分DNA 以染色粒形式存在, 没有转录活性, 而侧环是RNA 转录活跃的区域, 一个侧环往往是一个大的转录单位, 有的是由几个转录单位构成的。灯刷染色体侧环上的RNA 主要是mRNA, mRNA 与蛋白质结合形成无活性的RNP 颗粒, 这些颗粒贮存在卵母细胞中, 以便受精之后使用。与DNA 结合并贮存起来的蛋白主要是转录因子, 如FRGY2, 在卵母细胞生长过程可选择性地调节基因表达。灯刷染色体除了具有合成和贮存的作用外, 对于卵子发生期的核糖体合成有重要作用。在卵子发生的生长期, 需要大量的核糖体。细胞核必须供给大量的核糖体RNA 给细胞质体积已经很大的卵母细胞, 势必给细胞核中核糖体基因的转录带来严重的负担。为缓解这一问题, 需要选择性地扩增rRNA 基因, 其结果, rRNA基因的拷贝数成千倍的增加, 这就相当于增加了核仁的数量。
14. 核仁的结构和组成如何?
答: 核仁呈圆或卵圆形, 无外界膜包围, 是由多种组分形成的一种网络结构:① 纤维中心(fibrillar centers FC): 呈浅染区, 位于核仁的中央部位, 直径2~3 nm, 能被RNA 酶消化, 由DNA 和RNA 组成。② 致密纤维组分(dense fibrillar component, DFC): 位于浅染区周围, 直径为5~10nm 的致密纤维, 含有正在转录的RNA 分子。③ 颗粒区(granular component, GC): 呈致密的颗粒, 直径为15-20nm 。位于周边, 代表已合成的核糖体前体颗粒。④ 其他结构: 核仁除了上述3种基本结构外, 还有一些其他结构。如在核仁的周围有一层染色质, 被称为核仁相随染色质(nucleolar associated chromatin);有时, 染色质还深入到核仁内部, 称为核仁内染色质(intranucleolar chromatin), 保卫核仁的染色质称为核仁周边染色质(perinucleolar chromatin) 。此外, 还有核仁基质(nucleolar matrix) 或核仁骨架。核仁的三种基本组分都是以某种方式与rRNA 的转录与加工形成RNP 的不同事件相关。